摘 要：過氧化氫酶是生物體內的一種末端氧化酶，可以減輕甚至清除過氧化氫在體內聚積對機體造成的損傷，調控過氧化氫酶的生物合成對機體具有十分重要的意義。通過在黑曲霉發酵培養過程中分別加入不同的金屬離子，培養結束后進行細胞破壁，提取過氧化氫酶，檢測不同金屬離子對過氧化氫酶活力的影響。結果表明：在發酵培養的24h階段，增加CaCO3添加量，同時減少Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-+等離子的含量，既可提高菌體的生長速度，又可提高過氧化氫酶的產量。

　　關鍵詞：過氧化氫酶;金屬離子;生物合成;影響

　　過氧化氫酶(CAT)是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內的末端氧化酶，能催化細胞內過氧化氫分解，防止過氧化物的形成，從而使細胞免于遭受過氧化氫的毒害。在人體正常生理條件下，過氧化氫酶可催化過氧化氫的快速分解，使H2O2失去活性氧的作用，且效果十分顯著。過氧化氫酶還被廣泛應用于面包和飲料的生產中，因其能分解H2O2產生O2和H2O的性質，可將過氧化氫酶和過氧化氫共同作為烘烤食品的膨脹劑。過氧化氫酶在對牛奶飲料等的消毒上應用更為廣泛。研究表明，利用過氧化氫酶降解工業廢水中過氧化氫，不僅可以避免對環境造成二次污染，同時對芳香和脂肪烴化合物進行降解也相當有效。過氧化氫酶價格低廉且化學性質穩定，已在很多含酚廢水的污水處理中得到廣泛應用。在紡織生產過程中，過氧化氫酶還可快速安全地清除H2O2，既減少了染色布磨損，又有利于保護環境。過氧化氫酶還被廣泛應用于工業酶催化中，降低工業酶催化過程中產生的副產物的積累或酶發生降解等不良影響。Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等是人體必需的生命元素，研究這些離子對過氧化氫酶穩定性和酶活性的干擾具有生物學和醫學意義。為此，筆者利用黑曲霉在不同離子作用的條件下發酵產生過氧化氫酶，測定酶活力，探討不同離子對過氧化氫酶生物合成的影響，以期通過控制離子含量來提高過氧化氫酶活性，進而降低過氧化氫對機體造成的損害。

　　1 材料與方法

　　1.1 培養基制備 霉菌分離培養基(馬丁氏培養基)：K2HPO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂15～20g、水1000mL、1%孟加拉紅水溶液3.3mL，無菌操作時加1%的鏈霉素使其終濃度為30μg/mL。發酵培養基：5% 葡萄糖、0.012% MgSO4、0.2% KCl、0.015% KH2PO4、0.06% NH4H2PO4、0.2%蛋白胨、0.3%牛肉膏。

　　1.2 菌種篩選 取適量土樣置于裝有無菌水的錐形瓶中攪拌，使采集的泥土分散成均勻的土壤懸液，將涂布好樣品的平板放在恒溫培養箱中培養，培養箱溫度28℃，倒置培養2～3d。

　　1.3 菌種發酵培養 接種篩選出的黑曲霉純培養物的種子液，30℃條件下搖床，轉速為160rpm。將得到的種子液接種于含15%葡萄糖的發酵培養液，接種量為10%(w/w)，溫度32℃，pH自然，搖床培養，培養時間48h。

　　1.4 過氧化氫酶活性測定 對發酵液進行過濾，離心后用緩沖液清洗沉淀，得到菌體細胞;將所得細胞用細胞破碎儀進行破壁，細胞破碎儀功率為80W，超聲3s，共操作180～200次，每次間隔3s;細胞破壁工作結束后進行離心操作，4000rpm/min，持續10min，取上層液體作為酶液，用紫外分光光度法測定其酶活力。酶活力的測定標準曲線制作：取6只小試管并分別編號，按表1所示依次加入對應試劑，然后振蕩試管搖勻，在350nm處以0號管調零，繼而分別測定另外5只試管的吸光度。樣品檢測：依次加入1.5mL緩沖溶液、0.1mL酶提取液、1.2mL蒸餾水，然后加入0.2mL過氧化氫溶液，立刻計時4min后加入1mL硫酸終止反應，測定350nm吸收值。分別測定幾種金屬離子存在的條件下，黑曲霉培養24h及48h產過氧化氫酶的活力，計算方法如下：

　　[E=aAK-AS+bwt×250.1] (1)

　　式中：AK為對照樣吸光度;AS為樣品吸光度;wt為反應時間;a、b為標準曲線參數。

　　1.5 菌體干重測定 取10mL發酵液，放在烘干且達到衡重的濾紙上進行過濾，為使不溶的碳酸鹽溶解，加入2mol/L HCL使其轉變為可溶的氯化鹽，然后用蒸餾水沖洗。將收集的濾液用細菌濾器再過濾，最后將吸附有菌體的過濾器在烘箱(100℃)內干燥4h稱重。分別測定幾種金屬離子存在的條件下，培養24h及48h的黑曲霉菌體重量。

　　2 結果與分析

　　2.1 過氧化氫酶標準曲線 由圖1可知，標準曲線的方程為y=1.215x+0.0311，截距(a)為0.0311，斜率(b)為1.215，相關系數R2=0.9916。

　　2.2 不同金屬離子對菌體生長和條件以及過氧化氫酶的影響

　　2.2.1 pH 由圖2可知，培養液中添加了CaCO3能夠明顯抑制培養基pH下降，添加其他離子的培養液pH也較對照略高，但抑制pH下降的功能不明顯。

　　2.2.2 菌體干重 由圖3可知，除CaCO3以外，其他金屬離子在培養24h后對菌體生長都具有一定的抑制作用，培養時間達到48h后，Cl-、PO43-菌體生長具有小幅促進作用，雖然加入了Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+的培養基中菌體干重依然低于對照，但高于同條件下培養24h的菌體干重，說明Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+對菌體生長依然有抑制作用;而CaCO3在整個培養過程中對菌體生長都有促進作用，加入了CaCO3培養48h后的菌體干重達到22.8mg/mL，這與CaCO3能夠抑制pH下降相關。

　　2.2.3 過氧化氫酶活力 由圖4可知，培養24h后，對照過氧化氫酶活力為32.4IU，而加入了CaCO3培養24h后的過氧化氫酶活力為112.9IU，明顯高于對照。由此可見，CaCO3對菌體生長及過氧化氫酶的酶活力提高均具有明顯的促進作用。除了加入ZnCO3的培養基外，其余金屬離子培養液中過氧化氫酶活力都高于對照，說明Zn2+對過氧化氫酶活力具有最明顯的抑制作用。

　　3 結論與討論

　　試驗結果表明：CaCO3對黑曲霉菌體生長及過氧化氫酶的合成具有促進作用。培養24h時，Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-對黑曲霉菌菌體生長及過氧化氫酶的生物合成具有抑制作用;培養48h時，只有Zn2+對黑曲霉菌菌體生長及過氧化氫酶的合成均具有抑制作用。因此，發酵工業上，在發酵培養的24h階段，可以通過控制CaCO3加入來提高菌體的生長速度及過氧化氫酶的活力，同時要避免Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-等離子的產生;在發酵培養的48h期間，要避免Zn2+的產生，可以有效減輕過氧化氫對發酵的危害，使菌體保持較快的生長速度，也可使過氧化氫酶的活力達到較高水平。

　　參考文獻

　　[1]宋娟.“探究pH對過氧化氫酶的活性影響”實驗的改進和優化[J].生物學通報，2020，55(05)：51-53.

　　[2]張文婕，楊莉莉，王金花，等.三種抗生素與銅復合污染對土壤過氧化氫酶活性的影響[J].農業資源與環境學報，2020，37(01)：135-143.

　　[3]李宏觀，李玉，樊楊，等.毒死蜱和重金屬對近海沉積物堿性磷酸酶和過氧化氫酶活性的影響[J].海洋湖沼通報，2019(02)：107-115.

　　[4]王建，盧超超，蘆珊珊，等.蔬菜大棚土壤過氧化氫酶活性及與養分關系研究[J].甘肅科學學報，2018，30(02)：45-49.

　　[5]區敏儀，李海濤，楊蓉婭.真菌抗氧化酶的研究進展[J].國際皮膚性病學雜志，2017，43(01)：50-53.

　　推薦閱讀：金屬熱處理期刊投稿內容范圍