1 材料和方法

　　1.1 材料

　　獲取膝骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中廢棄的軟骨組織(經(jīng)患者及家屬同意，通過(guò)醫(yī)院倫理審查)。COL2A1、MMP13、miR-9 及 PRTG 檢測(cè)試劑盒(蘇州昂飛生物科技有限公司);蛇床子素(徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)研究室)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 軟骨細(xì)胞提取及培養(yǎng)

　　收集膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)置換術(shù)后廢棄的無(wú)菌軟骨標(biāo)本，置于無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)基，冰盒轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，去除多余組織，剪切成 1~3mm 碎塊。用 0.25% 胰蛋白酶和 0.2%Ⅱ 型膠原酶在 37℃恒溫?fù)u床中分別消化 30min 和 8h，過(guò)濾后收集濾液，1000r/min 離心 5min，棄上清，PBS 浸洗 2 遍，加入含 10% 血清 DMEM/F-12 培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，移入培養(yǎng)瓶，在 37℃、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)和貼壁情況，用第 3 代軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

　　1.2.2 軟骨細(xì)胞鑒定

　　形態(tài)學(xué)觀察：通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察原代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和生長(zhǎng)增殖情況并照相。

　　甲苯胺藍(lán)染色法：取第 3 代軟骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，貼壁后去除培養(yǎng)液，PBS 清洗 2 遍，4% 多聚甲醛固定 1h，1% 甲苯胺藍(lán)染色 30min，雙蒸水洗去多余染液，無(wú)水乙醇脫水，中性樹膠封片，倒置相差顯微鏡下觀察并照相。

　　1.2.3 細(xì)胞分組處理

　　取第 3 代軟骨細(xì)胞，分為空白對(duì)照組和不同濃度蛇床子素處理組(0、10、50、100、150μmol/L)，用含 10% 血清的 DMEM/F-12 培養(yǎng)液在 37℃、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　1.2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

　　96 孔培養(yǎng)板中每孔接種濃度為 5×10?個(gè) /mL 的軟骨細(xì)胞懸液，37℃孵育 4~6h，各組設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后加入不同濃度蛇床子素，孵育 24h，每孔加 10μL CCK-8 試劑，酶標(biāo)儀 450nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(OD)值估計(jì)細(xì)胞活力。

　　1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

　　收集處理后的第 3 代軟骨細(xì)胞，用碘化丙啶(PI)和異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的 AnnexinV 染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡并繪制散點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)凋亡率。

　　1.2.6 qRT-PCR 檢測(cè)

　　對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞采用 Trizol 法提取總 RNA，用 PrimeScript RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以 U6 作為內(nèi)參，用 ABI7500 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，Opticon Monitor3 軟件分析結(jié)果。引物序列如下：

　　目的基因引物序列

　　U65'-GCTTCGGCAGCACATATACT-3';5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3'

　　miR-95'-GGAGTCCGTGTGTCTGTGTG-3';5'-GCTTTATGACGGCTCTGTGG-3'

　　COL2A15'-GACGCCACGCTCAGTC-3';5'-TCTCCGCTCTTCCACTCTG-3'

　　MMP135'-TGGGCCTTCTGGTCTTC-3';5'-GTTGTAGCCTTTGGAGATG-3'

　　PRTG5'-CGAAGCAAAGCCAGGAAGTC-3';5'-GCTTGTTGTGAATCCCTGAGCG-3'

　　Caspase-35'-AAGCGAATCAATGGACTCTGG-3'

　　1.2.7 Western Blot 法檢測(cè)

　　對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期軟骨細(xì)胞加蛋白裂解液提取總蛋白，Bradford 法定量。總蛋白(50μg)經(jīng) 12% SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，與抗 COL2A1、MMP

　　13、miR-9、PRTG、Caspase-3 及 β-actin 單克隆抗體 4℃孵育過(guò)夜。PBST 洗膜 3 次(每次 5min)，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育 2h，洗膜后用魯米諾試劑和過(guò)氧化氫溶液(1∶1)顯色，掃描拍照分析，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶灰度值之比作為蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

　　采用 SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以 x±s 表示，組間比較用單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用布朗 - 福賽斯和韋爾奇方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

　　軟骨細(xì)胞多呈多邊形，甲苯胺藍(lán)染色后細(xì)胞核為藍(lán)色。0、10、50、100μmol/L 蛇床子素處理后的軟骨細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。CCK-8 實(shí)驗(yàn)顯示，蛇床子素濃度超過(guò) 100μmol/L 時(shí)細(xì)胞活力顯著下降，≤100μmol/L 時(shí)對(duì)軟骨細(xì)胞無(wú)毒，其中 100μmol/L 蛇床子素的保護(hù)作用最強(qiáng)。

　　2.2 軟骨細(xì)胞凋亡情況

　　空白對(duì)照組軟骨細(xì)胞凋亡率為 14.60%±1.21%，0、10、50μmol/L 蛇床子素處理組凋亡率(13.25%±1.32%)無(wú)明顯變化;100μmol/L 蛇床子素處理組凋亡率降至 5.67%±1.43%，與對(duì)照組及低濃度組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);150μmol/L 組凋亡率為 10.31%±1.16%，與 100μmol/L 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明 100μmol/L 蛇床子素抑制軟骨細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)。

　　2.3 qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

　　空白對(duì)照組及 0、10、50、150μmol/L 蛇床子素處理組中，miR-9、COL2A1、MMP13、PRTG 及 Caspase-3 的 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化;100μmol/L 蛇床子素處理組中，miR-9 和 COL2A1 表達(dá)上調(diào)，MMP13、PRTG 及 Caspase-3 表達(dá)下調(diào)，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示蛇床子素可能通過(guò)上調(diào) miR-9 抑制 PRTG 表達(dá)，調(diào)節(jié) p53/Caspase-3 通路，抑制軟骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解。

　　2.4 Western Blot 法檢測(cè)結(jié)果

　　0、10、50、150μmol/L 蛇床子素處理組中，miR-9、COL2A1、MMP13、PRTG 及 Caspase-3 的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化;100μmol/L 蛇床子素處理組中，miR-9 和 COL2A1 蛋白表達(dá)上調(diào)，MMP13、PRTG 及 Caspase-3 蛋白表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí) 100μmol/L 蛇床子素可抑制軟骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解。

　　3 討論

　　膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)以膝關(guān)節(jié)疼痛、畸形及功能障礙為特征，蛇床子素(OST)具有抗氧化、止痛等作用，可能通過(guò)調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖與凋亡緩解軟骨退變。本研究顯示，100μmol/L 蛇床子素可顯著減少膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡，上調(diào) miR-9 和 COL2A1 表達(dá)，下調(diào) MMP13、PRTG 及 Caspase-3 表達(dá)(P<0.05)。

　　機(jī)制上，miR-9 在 KOA 患者中表達(dá)降低，可通過(guò)靶向 PRTG 基因調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞活性;PRTG 過(guò)表達(dá)會(huì)激活 p53/Caspase-3 通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡。蛇床子素可能通過(guò)上調(diào) miR-9 抑制 PRTG 和 Caspase-3，阻斷軟骨細(xì)胞凋亡及基質(zhì)降解，從而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，緩解骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。

　　本研究存在局限性，如軟骨細(xì)胞來(lái)源單一，后續(xù)需通過(guò)不同供體樣本及基因敲除動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論。

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