摘 要：為了解滁州鯽遺傳種質(zhì)資源現(xiàn)狀，采用線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b和控制區(qū)為分子標(biāo)記，研究了滁州鯽保種群體和野生群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。研究獲得了長(zhǎng)度分別為990bp的Cyt b部分序列和907bp的控制區(qū)全序列。2個(gè)群體相比較，保種群體遺傳多樣性略低于野生群體。總體而言，基于線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b和控制區(qū)均顯示滁州鯽的遺傳多樣性偏低，但2個(gè)群體在2種分子標(biāo)記中均不存在顯著的遺傳分化;不同序列間比較，2個(gè)群體的控制區(qū)不僅A+T含量更高，還具有更高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，表明控制區(qū)更適于研究滁州鯽的群體遺傳變異。

　　關(guān)鍵詞：滁州鯽;細(xì)胞色素b;控制區(qū);遺傳多樣性

　　滁州鯽(Carassius auratus)，因產(chǎn)于安徽省滁州市滁河而得名，尤其盛產(chǎn)于滁州市西澗湖中[1]，多年來(lái)該湖中鯽魚(yú)自然生息繁衍，最高年產(chǎn)量達(dá)10000kg，捕撈個(gè)體一般在500g以上，最大個(gè)體達(dá)2kg以上。滁州鯽以個(gè)體大，味道鮮美、色澤亮麗深受消費(fèi)者青睞。早在明朝，《滁州志》就有記載：“滁州西澗鯽魚(yú)因其味美、功能表花，尤膾炙人口;肉肥厚細(xì)嫩，味甘香鮮醇、烏背金鱗，銀光閃閃，更名聞遐邇”。食者無(wú)不贊不絕口，因而價(jià)格也遠(yuǎn)高于一般鯽魚(yú)。20世紀(jì)90年代以來(lái)，省內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了滁州鯽相關(guān)基礎(chǔ)研究，發(fā)現(xiàn)滁州鯽是生物進(jìn)化過(guò)程中形成的地方性天然三倍體鯽魚(yú)種群，有雌核發(fā)育特性，系全國(guó)六大自然三倍體鯽魚(yú)品系之一，具有色澤亮麗、食性雜、生長(zhǎng)快、病害少的特點(diǎn)[2-4]，有較高的選育種價(jià)值和廣闊的推廣前景，2017年滁州鯽獲批為中華人民共和國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品，但滁州鯽資源保護(hù)不夠完善，品種選育還有很大潛力。

　　近年來(lái)，隨著滁州鯽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，對(duì)滁州鯽苗種的需求量也越來(lái)越大，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中存在種質(zhì)退化和品種混雜等問(wèn)題，從而降低了其優(yōu)良生產(chǎn)性能。而各種自然和人為因素導(dǎo)致其自然棲息地如西澗湖野生資源銳減，從而限制了滁州鯽繁育、養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展。目前滁州鯽的資源開(kāi)發(fā)利用僅限當(dāng)?shù)貥O少數(shù)周邊地區(qū)。究其原因，有關(guān)滁州鯽的研究遠(yuǎn)不夠充分，且主要集中在傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、繁殖、養(yǎng)殖等基礎(chǔ)生物學(xué)方面[5-9]，對(duì)其野生甚至保種群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀缺乏研究，限制了滁州鯽的資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用。本研究以滁州鯽保種和原產(chǎn)地西澗湖野生群體為對(duì)象，通過(guò)采用群體遺傳學(xué)廣泛使用的線(xiàn)粒體細(xì)胞色素b和控制區(qū)(D-loop)基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，分析其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為滁州鯽進(jìn)一步的種質(zhì)資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 2021年6—8月，滁州鯽樣品分別采自滁州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水產(chǎn)科研基地和西澗湖調(diào)查樣本，測(cè)量體重后，每個(gè)群體隨機(jī)取30尾樣品魚(yú)，剪取魚(yú)體右側(cè)背部肌肉保存于無(wú)水乙醇中備用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因組的提取、PCR擴(kuò)增與測(cè)序 采用動(dòng)物基因組提取試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit)，按照提示的操作步驟提取基因組DNA。Cyt b擴(kuò)增和測(cè)序引物均為L(zhǎng)14724和H15915[10]，D-loop區(qū)擴(kuò)增引物為CR1和CR2[11]。PCR擴(kuò)增采用常規(guī)方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司純化測(cè)序。

　　1.2.2 序列與群體遺傳分析 使用軟件Seaview[12]和Bioedit[13]對(duì)相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)、拼接，并經(jīng)人工校正。采用軟件DNAsp 5.0[14]計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目、單倍型數(shù)目、單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd)和核苷酸多樣性(nucleotide diversity，Pi)。利用Mega 4.0軟件[15]計(jì)算序列堿基組成、序列變異率、轉(zhuǎn)換與顛換比值、群體內(nèi)和群體間遺傳距離。由Arlequin 3.5軟件[16]計(jì)算群體分化指數(shù)(Fst)。群體間基因流(Nm)由公式Nm=(1/Fst-1)/2[17]計(jì)算得出。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 序列分析 經(jīng)整理后得到長(zhǎng)度一致為990 bp的線(xiàn)粒體Cyt b基因同源序列，包括從其起始端第16位至1015位，所有序列無(wú)插入和缺失。60條序列共檢測(cè)到6個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)率較低(0.61%)，包括簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4個(gè)，單突變位點(diǎn)2個(gè)。線(xiàn)粒體Cyt b序列變異主要發(fā)生在密碼子第3位，僅少數(shù)發(fā)生在第1位和第2位，且全為同義突變，符合魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體中具有較慢的氨基酸變化速率的特征[18]。獲得所有樣本的線(xiàn)粒體控制區(qū)全序列長(zhǎng)度一致為907bp，共檢測(cè)到8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)(多態(tài)率僅0.88%)，包括簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)7個(gè)，單突變位點(diǎn)1個(gè)。

　　基于線(xiàn)粒體Cyt b和D-loop序列的滁州鯽2個(gè)群體的堿基組成見(jiàn)表1。相同序列的兩群體間堿基組成一致，具有明顯的AT偏好(A+T含量57.5%)和反G偏倚(G含量14.0%)，符合脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體基因堿基組成的普遍特征[19]。但Cyt b密碼子不同位次上堿基組成差異很大，從第1位的均衡到2、3位堿基G的含量越來(lái)越低。而與Cyt b序列比較，控制區(qū)具有更明顯的AT偏好，A+T含量高達(dá)65.4%。

　　2.2 群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu) 滁州鯽2個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表2。除基于Cyt b的保種群體和總?cè)后w的單倍型多樣性較低，其他群體單倍型多樣性較高(>0.5)，基于2個(gè)線(xiàn)粒體標(biāo)記的所有群體核苷酸多樣性均較低(<0.01)。而所有群體的核苷酸多樣性均較低。2個(gè)群體間比較，基于2個(gè)標(biāo)記的野生群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均遠(yuǎn)大于保種群體，顯示野生群體遺傳多樣性高于保種群體。不同標(biāo)記間比較，基于D-loop區(qū)序列的所有遺傳多樣性參數(shù)均明顯大于Cyt b序列。

　　基于線(xiàn)粒體Cyt b和D-loop區(qū)的滁州鯽群體間遺傳距離均較小(<0.001)，且與2個(gè)群體內(nèi)的遺傳距離相差不大。基于2個(gè)標(biāo)記的保種群體和野生群體間遺傳分化指數(shù)Fst均較小(<0.05)，顯示群體間無(wú)顯著遺傳分化。

　　3 討論與結(jié)論

　　遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是物種或群體長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物，也是其生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提，其遺傳多樣性大小代表生物適應(yīng)環(huán)境變化能力的強(qiáng)弱，既可揭示物種或群體過(guò)去的進(jìn)化歷程，也能分析其進(jìn)化潛力和未來(lái)命運(yùn)。單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)是衡量群體遺傳多樣性高低的重要參數(shù)，相比較單倍型多樣性，核苷酸多樣性更能體現(xiàn)遺傳多樣性的狀況。研究結(jié)果顯示：基于線(xiàn)粒體Cyt b和D-loop2種分子標(biāo)記的滁州鯽保種群體、野生群體和總?cè)后w的單倍型遺傳多樣性(0.310～0.590)偏低或略高，而核苷酸多樣性(0.00045～0.00097)則全部偏低(<0.05)。這表明，滁州鯽的遺傳多樣性總體偏低，并低于其他地區(qū)的鯽魚(yú)群體，如低于基于線(xiàn)粒體COI序列的西江鯽8個(gè)群體的遺傳多樣性(Hd：0.714-0.917，Pi：0.0027-0.0087)[20]、基于線(xiàn)粒體控制區(qū)的都柳江鯽的遺傳多樣性(Hd：0.893，Pi：0.0063)[21]、基于線(xiàn)粒體Cyt b序列和D-loop區(qū)野生鯽魚(yú)的遺傳多樣性(Hd：0.933，Pi：0.00262、0.01127)[22]。滁州鯽遺傳多樣性較低的原因除了其天然分布范圍較窄、野生種群較小的緣故之外，主要是受到人類(lèi)活動(dòng)的影響：滁州鯽的主要棲息地西澗湖位于城區(qū)邊緣，有發(fā)電廠利用其水發(fā)電，導(dǎo)致西澗湖水位晝降夜升，而鯽魚(yú)把受精卵產(chǎn)于水草，但由于白天水位下降且氣溫升高使其難以孵化。

　　滁州鯽保種群體遺傳多樣性低于野生群體，可能與奠基者效應(yīng)導(dǎo)致的種群遺傳多樣性水平較低有關(guān)。這種保種或養(yǎng)殖群體遺傳多樣性低于野生群體的現(xiàn)象在許多魚(yú)類(lèi)研究中均有報(bào)道，如歐陽(yáng)美等[23]基于線(xiàn)粒體Cyt b基因序列對(duì)長(zhǎng)江中上游草魚(yú)野生和養(yǎng)殖群體遺傳多樣性進(jìn)行了比較研究，結(jié)果顯示草魚(yú)群體多樣性水平大小依次是：野生群體>原種場(chǎng)群體>苗種場(chǎng)群體>放流群體。為提高保種群體的遺傳多樣性，可加大從野生群體采集更多單倍型個(gè)體，更新保種群體親本。

　　基于2種分子標(biāo)記的滁州鯽單倍型間最大變異率很低(0.61%、0.88%)，顯示為種內(nèi)級(jí)別的差異。與線(xiàn)粒體Cyt b序列比較，兩群體的控制區(qū)不僅A+T含量更高，還具有更高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，表明控制區(qū)更適于研究滁州鯽的群體遺傳變異。群體遺傳結(jié)構(gòu)上，當(dāng)遺傳分化指數(shù)Fst在0至0.05 間為無(wú)分化，0.05至0.15 間為中度分化，0.15至0.25 間為高度分化[23]。基因交流程度是影響群體遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素，當(dāng)群體間基因流Nm≥4時(shí)，基因流則成為主導(dǎo)因素，可防止群體間遺傳漂變[24]。本研究基于Cyt b序列和D-loop的滁州鯽兩群體間遺傳差異分析結(jié)果中Fst均小于0.05、Nm均遠(yuǎn)大于4，表明2個(gè)群體間基因交流頻繁、遺傳差異較小，群體間無(wú)顯著遺傳分化。這可能與保種群體均取自野生群體并定期更新有關(guān)，保種群體繁育的后代放流到西澗湖，因而2個(gè)群體間存在定期的基因交流，遺傳差異不明顯。