摘要 目的：通過網絡藥理學和分子對接技術探究舒眠膠囊治療失眠的作用機制。方法：以網絡藥理學為基礎，對舒眠膠囊、失眠相關作用靶點進行篩選，應用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)和Swiss Target Prediction數據庫預測舒眠膠囊靶點，應用GeneCards等5個數據庫收集失眠相關靶點數據;運用STRING數據庫、DAVID數據庫、Cytoscape 3.5.1軟件對藥物和疾病的交集基因進行蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析，并構建“有效成分-靶點-疾病”圖，分析舒眠膠囊治療失眠的作用機制;最終，利用Discovery Studio軟件進行分子對接模擬驗證。結果：舒眠膠囊通過35個活性成分作用于120個失眠相關靶點。主要通過槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、燈心草菲類衍生物8個主要活性成分，作用于PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6等14個核心靶點，通過調控Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、PI3K/AKT信號通路起治療失眠作用。分子對接結果顯示關鍵活性成分與核心靶點對接良好。結論：舒眠膠囊通過多靶點、多通路發揮抗炎作用，從而改善失眠。

　　關鍵詞 舒眠膠囊;酸棗仁;失眠;網絡藥理學;分子對接;中成藥;作用機制;炎癥

　　失眠是以睡眠時長或深度不足為主癥，患者自覺影響到白天功能及活動的一種主觀感覺[1]。國際睡眠障礙分類第三版明確指出，慢性失眠在人群中的患病率為9% ～12%，中國睡眠研究會2017年發布的報告顯示，我國失眠的患病率達38%，遠高于世界平均水平[2]。失眠發病機制復雜，是心血管疾病、慢性疼痛綜合征、抑郁、焦慮、糖尿病、肥胖和哮喘等疾病的危險因素之一[3]。當前對于失眠的治療仍以藥物干預為主，代表性藥物為苯二氮 艸 卓 類藥物，這類藥物起效速度快，對失眠癥改善明顯，然而，長期使用該藥物存在精神錯亂、認知障礙、藥物成癮性和戒斷反應等不良反應[4]。舒眠膠囊是一種中成藥，由酸棗仁、柴胡、白芍、合歡皮、合歡花、僵蠶、蟬蛻和燈心草8味中藥組成，因其較好的臨床療效和良好的依從性而被廣泛應用于臨床[5]。因此，探究舒眠膠囊治療失眠的作用機制具有重要意義。

　　網絡藥理學基于人工智能和大數據背景，運用數據庫搜索、計算機模擬等技術，整合已知的臨床、實驗數據，預測藥物治療疾病的成分、靶點和通路，揭示三者的相互關系網絡，適用于中草藥復雜作用機制的初步探究[6]。本研究采用網絡藥理學方法解釋舒眠膠囊和失眠的網絡關系，預測舒眠膠囊治療失眠的調控機制，利用分子對接技術驗證預測。基于網絡藥理學和分子對接探究舒肝解郁膠囊治療失眠作用機制流程見圖1。

　　1資料與方法

　　1.1舒眠膠囊化合物、作用靶點檢索

　　通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https：//tcmspw.com)檢索并篩選舒眠膠囊8味中藥的有效成分和作用靶點，篩選條件為口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18，采用Swiss Target Prediction數據庫及文獻檢索等方法進行補充檢索，基于Unitprot數據庫(https：//www.Unitprot.org/)將靶點蛋白轉化為對應基因名。結合文獻納入原兒茶酸、兒茶醛、霉酚酸內酯等經文獻報道的藥物化合物[7-8]。

　　1.2疾病靶點預測

　　以“Insomnia”為關鍵詞，檢索GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(https：//omim.org/)、Drugbank數據庫(https：//www.pharmgkb.org/)、DisGeNET數據庫(https：//www.disgenet.org/)、中醫藥整合藥理學研究平臺(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP)(http：//www.tcmip.cn)查找失眠的相關靶點，去重后在Uniprot中轉化為對應基因名。

　　1.3交集靶點的篩選

　　在微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn/)在線平臺上分別錄入1.1項下舒眠膠囊預測靶點和1.2項下失眠相關靶點，繪制韋恩圖。

　　1.4蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析

　　基于STRING數據庫(https：//string-db.org/)獲取1.3項下靶點蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)，設置物種為人(homo sapines)，最高置信度>0.9，并利用Cytoscape 3.5.1軟件分析PPI網絡，用拓撲方法評估核心網絡，以“節度值(Degree DC)大于2倍中位數”為篩選條件，滿足篩選條件的靶點為舒眠膠囊發揮作用的核心靶點蛋白。

　　1.5基因本體富集分析和京都基因和基因組百科全書富集分析

　　對核心靶點進行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，分析平臺為DAVID數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)，分析結果以氣泡圖形式呈現，探究舒眠膠囊治療失眠可能的作用機制。

　　1.6“有效成分-靶點-疾病”網絡構建及分析

　　基于Cytoscape 3.5.1軟件，構建舒眠膠囊中藥組成、有效成分與作用靶點間相互作用的網絡圖，結合失眠相關靶點，形成舒眠膠囊與失眠相互作用的網絡圖，對后者所形成的“有效成分-靶點-疾病”網絡進行分析評估，設置“節度值(Degree DC)>2倍中位數”，篩選舒眠膠囊治療失眠癥的主要活性成分。

　　1.7核心靶點的分子對接模擬驗證

　　利用Discovery Studio軟件，對1.4項下篩選出的核心靶點和1.6項下篩選出的關鍵活性成分進行分子對接模擬驗證，二者的結構信息分別來源于RCSBPDB數據庫(http：//www.rcsb.org/)和Pubchem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。

　　2結果

　　2.1舒眠膠囊有效成分篩選

　　共收集到41個有效成分，297個藥物靶點。見表1。875E204C-D465-43B7-946D-FEFA86E0F319

　　2.2疾病靶點采集

　　共得到失眠癥相關基因1 295個。

　　2.3“藥物-有效成分-靶點”網絡模型的構建

　　舒眠膠囊藥物-有效成分-靶點可視化網絡包括346個節點，988條相互關系。圖中的紅色圓形、綠色菱形、藍色三邊形分別代表舒眠膠囊的8味中藥，41個有效成分和297個藥物靶點。見圖2。

　　2.4交集靶點篩選

　　舒眠膠囊藥物靶點297個和失眠相關靶點1 295個，取交集獲得120個交集靶點。見圖3。

　　2.5PPI關系網絡分析

　　來自STRING平臺(120個節點，380條邊)，PPI enrichment p-value：<1.0e-16，average node degree：6.33，avg.local clustering coefficient：0.542。來自Cytoscape 3.5.1(105個節點、380條邊)，節點越大，顏色越深，則Degree值越高。見圖4。

　　獲得14位靶點為核心靶點。Degree值排名前6位的靶點為APP、PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6，因APP靶點與失眠疾病的相關性過低，選取后5位靶點作為舒眠膠囊治療失眠的關鍵靶點進行分子對接。見表2。

　　2.6GO富集分析及KEGG通路富集分析

　　結果顯示，涉及的生物過程主要包括RNA轉錄、炎癥反應、脂多糖介導的細胞反應等。見圖5。

　　前10位通路的 P 值(富集顯著性)均小于0.05，表示分析可信度高。其中，Toll樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B，PI3K/AKT)信號通路與失眠發生機制密切相關，且3條通路均為炎癥相關通路。PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6均出現在Toll樣受體信號通路，APP未富集在前10位通路中。見圖6。

　　2.7“舒眠膠囊有效成分-失眠-靶點”網絡模型的構建及分析

　　舒眠膠囊與失眠PPI網絡涉及8味中藥，35個活性成分，120個交集靶點和1個疾病，分別用紅色圓形、綠色菱形、藍色三角形和黃色正方形表示。見圖7。獲得的18個活性成分可能是舒眠膠囊治療失眠的主要活性成分，選取Degree值前8位的主要活性成分作為舒眠膠囊的關鍵活性成分進行分子對接。見表3。

　　2.8分子對接模擬驗證

　　所有對接的最低結合能結果均小于0，說明配體與受體均可自發結合，其中PIK3R1蛋白與9個小分子結合的最低結合能均小于-5 kJ/mol，結合效果整體要優于其他4種，而CXCL8蛋白結合效果較差。A3(山柰酚)、DXC4(燈心草菲類衍生物)與5位靶點基因的結合能均小于陽性藥物，A4(槲皮素)、DXC2(木犀草素)、DXC11與4位靶點基因的結合能均小于陽性藥物，A4、A3、DXC2、DXC11及DXC4可能是舒眠膠囊治療失眠的關鍵成分。見圖8。

　　PIK3R1與DXC4在Val851形成氫鍵，且作用距離為3.18 ;TNF與A3在Tyr151形成氫鍵，且作用距離為2.67 ;CXCL8與DXC5無氫鍵作用，這可能是結合力不高的原因;AKT1與A4在Ala123、Glu234和Asp292形成氫鍵，且作用距離為3.01 、2.66 和2.70 ;IL6與A4在Glu672、Met704和Asp784形成4個氫鍵，且作用距離為3.01 、2.64 、2.97 和2.98 ;PIK3R1與Zolpidem在Gln859形成氫鍵，且作用距離為3.22 。見圖9～14(A：小分子-蛋白對接，B、C：小分子與蛋白對接細節)。

　　3討論

　　舒眠膠囊治療失眠療效確切，多項隨機對照試驗結果顯示，舒眠膠囊對比陽性藥物，在失眠治療中有效率更高[9]。中醫將失眠稱為不寐，多因肝郁化火傷陰，動搖心神，神不安而不寐。本方可用于肝郁傷神所致的失眠癥，其中酸棗仁和柴胡以其寧心安神、疏肝解郁的功效共為君藥;白芍、合歡皮、合歡花3藥為臣，養血柔肝、解郁安神;僵蠶歸肝、肺、胃經，息風止痙、化痰散結，蟬蛻歸肺、肝經，散風除熱、疏肝解痙，二藥共調肝臟，祛痰熄風，為佐藥;燈心草性寒，既可清心火，又可利小便以引導心火下降，為使藥。諸藥配合可達疏肝解郁、寧心安神之效。

　　酸棗仁為養心安神之要藥，有效成分包括酸棗仁總皂苷、總黃酮、總生物堿等化合物，已被證實具有催眠、鎮靜作用。Yan等[10]酸棗仁水提物聯合戊巴比妥鈉喂給失眠模型小鼠，結果顯示，小鼠睡眠潛伏期顯著縮短，睡眠時間明顯增加，其催眠作用可能與單胺類神經遞質水平增加、神經遞質合成中的氨基酸代謝改變相關。柴胡是傘形科植物柴胡的干燥根，具有疏肝解郁的功效，研究顯示，柴胡中的柴胡皂苷通過促進腦脊液中5-羥色胺的分泌改善失眠[11]。2021年西安交通大學醫學部的一項實驗中，梁凡凡等[12]將舒眠膠囊分別喂給戊巴比妥鈉給藥小鼠和PCPA失眠大鼠，結果顯示，舒眠膠囊具有鎮靜、催眠的作用，其具體作用機制與提高腦組織伽馬氨基丁酸水平、降低葡萄糖水平、上調海馬5-羥色胺1a受體蛋白的表達相關。

　　3.1舒眠膠囊富集分析

　　根據GO富集與KEGG通路富集結果，舒眠膠囊通過多個途徑起治療作用。排除癌癥等通路后，結合失眠的發病過程與常見信號通路，舒眠膠囊可能通過以下3條炎癥介質相關通路發揮作用。

　　Toll樣受體(TLRs)信號通路是一個受體家族，參與病原體識別和宿主防御，其上游為內源性(損傷相關分子模式，DAMPs)或外源性(病原體相關分子模式，PAMPs)配體[13]。TLRs中的TLR4通路已被證明可以觸發和調節神經炎癥反應[14]。研究表明，睡眠剝奪增強了TLR4和其下游MyD88的過表達，MyD88通過觸發核因子κB和促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)的表達，上調促炎癥基因的表達[15]。875E204C-D465-43B7-946D-FEFA86E0F319

　　TNF是免疫系統重要的細胞因子，TNF信號通路的激活與細胞凋亡、細胞成活、炎癥和免疫等生物過程相關[16]。當TNF含量正常時，TNF通過節律性表達調控睡眠覺醒節律，延遲非快速眼動睡眠的覺醒時間，當TNF含量過高時，也發揮抑制正常睡眠的作用[17]，因此推測TNF信號通路與睡眠關系密切。

　　PI3K/AKT信號通路的下游基因為IL-6、TNF等炎癥介質基因，該信號通路的表達上調炎癥基因轉錄活性，促使血清中炎癥介質增加[18]。研究表明，快速眼動睡眠小鼠睡眠剝奪后可引起氧化應激和炎癥反應，剝奪睡眠7 d后，小鼠腦組織中的小膠質細胞和星形膠質細胞激活，下游PI3K/AKT/sk-3β的激活降低，炎癥介質水平增加，抗炎因子、轉錄因子Nrf-2和抗氧化劑酶HO-1的水平降低[19]。還有研究表明，ApoM-S1P可通過與S1PR2結合激活PI3K/AKT通路，增加PI3K和AKT磷酸化，減輕TNF-α誘導的人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)損傷和炎癥反應，阻止核因子κB的核轉運，降低凋亡相關蛋白、炎癥介質和黏附分子的表達[20-21]。

　　基于此，本研究推測舒眠膠囊可通過多個信號通路發揮治療失眠的功效，分子對接結果顯示，與關鍵有效成分對接良好的PIK3R1、TNF、AKT1、IL6均與炎癥通路相關，Toll樣受體信號通路、TNF信號、PI3K/AKT通路可能是舒眠膠囊治療失眠的關鍵機制之一。

　　3.2關鍵靶點的分析

　　通過SPRING分析得到舒眠膠囊的核心靶點有14位，其中，PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6等涉及炎癥反應相關的靶點節度值最高，分子對接結果表明這些靶點與關鍵活性成分有較好的結合力，說明舒眠膠囊可通過這些重要靶點發揮治療作用。PIK3R1基因是PI3K調節亞基的編碼基因，PI3K是細胞內重要的信號轉導分子，參與介導炎癥、應激等細胞反應[22]。蛋白激酶B AKT1調控神經細胞凋亡[23]，參與調節代謝、增殖、生長和血管的生成等過程[24]。CXCL8基因表達IL-8，IL-8屬于細胞因子的一種，可影響炎癥刺激。大量研究證明，睡眠障礙與IL-1β、IL-6、TNF等炎癥介質密切相關，炎癥介質通過調控睡眠覺醒周期、影響慢波睡眠而誘導失眠[25-26]。

　　總之，舒眠膠囊可能通過調節上述基因的表達，調控炎癥介質水平，介導炎癥反應，達到改善失眠癥狀的目的。

　　3.3舒眠膠囊的成分分析

　　槲皮素、山柰酚和木犀草素均為黃酮類化合物，實驗表明，黃酮類化合物可通過消除自由基、抗氧化作用而抑制炎癥、調節免疫[27]。槲皮素是自然界分布最廣的類黃酮化合物，具有抗炎、降低細胞毒性、增加5-羥色胺水平、抑制神經遞質伽馬氨基丁酸傳遞等作用[28]。木犀草素是燈心草經乙酸乙酯提取后含量最大的成分，已知對各種神經疾病如癲癇和阿爾茨海默病有神經保護作用，實驗表明木犀草素激活A1R、A2AR靶點表達，增加小鼠非快速眼動睡眠時間而改善失眠[29]。山柰酚可消除自由基、抗氧化、抑制神經元凋亡并促進神經再生[30]，也有研究表明山柰酚通過抑制核因子κB通路的激活，達到抑制神經炎癥及保護血腦屏障功能而改善大鼠腦缺血再灌注神經功能[31]。β-谷甾醇是一種常見的植物甾醇，可增加5-羥色胺和去甲腎上腺素等神經遞質水平改善失眠，還可減少NO的合成，抑制巨噬細胞IL-6活性，減少IL-1、TNF等炎癥介質的分泌，經抗炎作用改善失眠[32]。另外，DXC12、DXC11、DXC5、DXC4均為燈心草菲類衍生物，有實驗表明，燈心草菲類衍生物具有一定抗焦慮及鎮靜作用[33]，亦有研究表明DXC5即9，10-二氫類菲可影響小鼠DA及5-羥色胺的代謝，起到抗焦慮活性的作用[34]。

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