摘要：為了進(jìn)一步弄清干旱脅迫下NO產(chǎn)生的來(lái)源,本試驗(yàn)檢測(cè)了干旱脅迫下NOS和NR活性的變化。如圖3所示,干旱脅迫下大豆根中NOS和NR活性變化趨勢(shì)與NO產(chǎn)生趨勢(shì)一致。PEG處理顯著增加了NOS和NR活性,且NOS比NR增加的幅度大。結(jié)果表明,干旱脅迫下NO來(lái)源于NOS和NR兩條途徑,但是主要來(lái)源于NOS途徑。

　　關(guān)鍵詞：大豆種植,植物管理,農(nóng)業(yè)技術(shù)

　　逆境脅迫下,植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧,對(duì)植物造成氧化傷害。然而,植物在遭受逆境時(shí),其體內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的活性氧清除機(jī)制。研究表明,SOD、CAT和POD是幾種重要的抗氧化酶,在清除活性氧保護(hù)植物避免遭受活性氧誘導(dǎo)的氧化傷害中發(fā)揮著重要的作用[。現(xiàn)已在小麥、大豆、刺槐、枳[等多種植物中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫誘導(dǎo)的抗氧化酶活性的增加與植物的抗旱性有關(guān)。但有關(guān)抗氧化酶系統(tǒng)與植物抗旱性關(guān)系的研究結(jié)果也不盡相同,這可能與植物的種類、脅迫程度、抗氧化酶系統(tǒng)活性大小等因子的不同都有關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果表明,干旱脅迫處理增強(qiáng)了大豆根中SOD、CAT和POD活性,說(shuō)明大豆根中也存在著類似的活性氧清除的機(jī)制,這與莫紅等在干旱脅迫下大豆葉片抗氧化酶活性的研究中得到的結(jié)論是一致的。

　　然而,目前對(duì)于干旱脅迫下抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。大量證據(jù)表明,NO參與了植物多種非生物脅迫響應(yīng),包括鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫、UV-B輻射等,并能增強(qiáng)植物對(duì)逆境的耐受性。有證據(jù)表明,干旱脅迫下施用外源NO可增強(qiáng)抗氧化酶活性并緩解干旱脅迫對(duì)植物造成的傷害。本試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了外源NO可增強(qiáng)大豆根中抗氧化酶活性。這些研究結(jié)果表明NO可能參與了干旱脅迫條件下大豆中抗氧化酶活性的調(diào)節(jié),但是以前的研究都是集中在探討外源NO對(duì)抗氧化酶活性的影響,很少有探討干旱脅迫下內(nèi)源NO是否參與了大豆抗氧化酶活性調(diào)節(jié)的報(bào)道。

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　　本試驗(yàn)結(jié)果表明,干旱脅迫處理增加了大豆根中NO的產(chǎn)生,當(dāng)干旱脅迫誘導(dǎo)的NO被抑制或被清除時(shí),干旱脅迫誘導(dǎo)的抗氧化酶活性也被抑制,表現(xiàn)出與NO產(chǎn)生呈正相關(guān)的關(guān)系,表明NO參與了干旱脅迫下抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)。為了弄清干旱脅迫下內(nèi)源NO產(chǎn)生途徑,本試驗(yàn)中運(yùn)用了NOS和NR抑制劑。結(jié)果表明,NOS和NR抑制劑處理均抑制了干旱脅迫下NO的產(chǎn)生,并且NOS抑制劑處理比NR抑制劑處理抑制程度更大,表明干旱脅迫下NOS途徑和NR途徑干旱脅迫下均能產(chǎn)生NO,而且NOS途徑對(duì)NO產(chǎn)生的貢獻(xiàn)更大。為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)結(jié)論,本試驗(yàn)檢測(cè)了干旱脅迫下NOS和NR活性。結(jié)果表明,干旱脅迫增加了NOS和NR活性,并且NOS活性的增幅比NR活性的增幅大,表明干旱脅迫下NOS途徑對(duì)NO的產(chǎn)生確實(shí)起著主要作用。以前有研究報(bào)道,NOS介導(dǎo)的NO產(chǎn)生參與了擬南芥中鹽脅迫響應(yīng),而在紅蕓豆中發(fā)現(xiàn)NR介導(dǎo)的NO參與了鹽脅迫響應(yīng)。此外,干旱脅迫條件下NOS介導(dǎo)的NO產(chǎn)生參與了枳中干旱脅迫響應(yīng)。這些研究結(jié)果表明,植物中NOS途徑或NR途徑對(duì)NO產(chǎn)生貢獻(xiàn)的大小可能取決于植物種類和環(huán)境脅迫的種類。

　　干旱脅迫刺激了大豆根中NOS和NR活性的增加,從而增強(qiáng)了NO產(chǎn)生;增強(qiáng)的NO使干旱脅迫下抗氧化酶活性增強(qiáng),使得植物體內(nèi)避免活性氧的過(guò)量累積而對(duì)植物細(xì)胞造成氧化傷害,從而增強(qiáng)植物的抗旱性。但對(duì)于干旱脅迫下NO對(duì)抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

　　一氧化氮(NO)是生物體中重要的氧化還原信號(hào)分子,在植物體內(nèi)的酶促途徑主要是通過(guò)硝酸還原酶(NR)和一氧化氮合成酶(NOS)催化合成[6]。大量的研究表明,NO參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)過(guò)程,如種子萌發(fā)、根生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、防御相關(guān)基因的表達(dá)以及植物的耐逆反應(yīng)等[7,8]。近些年來(lái),NO對(duì)植物抗逆性調(diào)節(jié)作用的研究已經(jīng)受到了廣泛的重視。在小麥[3]、刺槐[9]、枳[10]等植物中的證據(jù)表明,施用外源NO可緩解干旱脅迫對(duì)植物造成的傷害,其原因與NO增強(qiáng)的抗氧化酶活性密切相關(guān)。但是,對(duì)于干旱脅迫下內(nèi)源NO是否參與了植物抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)目前還不清楚。

　　目前對(duì)于干旱脅迫下NO與抗氧化酶關(guān)系的研究多集中于外源NO對(duì)抗氧化酶系活性的影響,很少探討干旱脅迫下內(nèi)源NO對(duì)調(diào)節(jié)抗氧化酶系的作用。本研究以大豆為試驗(yàn)材料,利用NO清除劑、NO產(chǎn)生途徑相關(guān)抑制劑處理,探討了干旱脅迫下內(nèi)源NO在調(diào)節(jié)抗氧化酶中的作用以及干旱脅迫下NO的產(chǎn)生來(lái)源,以期為大豆抗旱機(jī)理的研究和選育抗旱品種提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1供試材料

　　供試大豆(Glycine max)品種為河南省大面積種植的豫豆19(種子由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供)。

　　1.2材料培養(yǎng)

　　挑選大小一致的大豆種子,用5%次氯酸鈉消毒15 min后,用自來(lái)水反復(fù)沖洗干凈,放入水中浸泡3 h使種子充分吸脹,然后將種子于恒溫箱內(nèi)25 ℃黑暗條件下萌發(fā)2 d。挑選萌發(fā)一致的大豆種子,將其種在放有蛭石的托盤里,并用1/4 Hoagland溶液澆灌。培養(yǎng)條件:25 ℃,14 h光周期,相對(duì)濕度控制在70%。

　　1.3材料處理

　　以聚乙二醇(PEG)6000模擬干旱脅迫處理。將生長(zhǎng)3 d的幼苗取出洗凈后轉(zhuǎn)移到盛有10% PEG、 100 μmol/L 硝普鈉(SNP)、200 μmol/L N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)、20 μmol/L疊氮化鈉(NaN3)和200 μmol/L 2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(PTIO)溶液的塑料容器中進(jìn)行不同處理。處理24 h后收集大豆主根用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

　　1.4測(cè)定方法

　　相對(duì)電導(dǎo)率采用DDS-307A型電導(dǎo)率儀測(cè)定,參照Wang等[11]的方法;丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[11];超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光氧化還原法[12],SOD活性以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位;過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定參照Wang等[12]的方法,CAT活性以消耗1 μmol(H2O2)/min為一個(gè)酶活性單位;過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[12],以每分鐘A470 nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位。NO含量通過(guò)氧合血紅蛋白向高鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化的量來(lái)計(jì)算,參照Murphy等[13]的方法;NOS和NR活性測(cè)定參照Tian等[14]的方法。所測(cè)指標(biāo)均選用大豆的主根為試驗(yàn)材料,3次重復(fù),取平均值。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1干旱脅迫對(duì)大豆幼苗相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量的影響

　　相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量是反映植物細(xì)胞遭受傷害程度的常用指標(biāo)。由圖1可知,5% PEG處理大豆1 d,根中相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量略微增加;隨著PEG用量的增加,相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量表現(xiàn)出顯著增加的趨勢(shì)。從形態(tài)上看,15% PEG處理時(shí),植株表現(xiàn)出明顯的萎蔫現(xiàn)象;20%PEG處理時(shí)則表現(xiàn)出非常嚴(yán)重的萎蔫。表明輕度脅迫(5% PEG)對(duì)大豆相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量影響較小,重度脅迫(>15% PEG)對(duì)其影響則較大。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果,后續(xù)試驗(yàn)選定中等脅迫程度(10% PEG)進(jìn)行干旱脅迫處理。

　　2.2干旱脅迫下NO對(duì)大豆幼苗抗氧化酶活性的影響

　　如表1所示,PEG處理顯著增加了大豆根中SOD、CAT和POD的活性,比對(duì)照分別增加了59.7%、91.5%和75.9%。SNP(NO供體)處理則進(jìn)一步增加了干旱脅迫下大豆根中SOD、CAT和POD活性,分別比PEG處理增加了15.2%、27.9%和33.3%。結(jié)果表明,外源NO可增加干旱脅迫誘導(dǎo)的抗氧化酶活性。PTIO(NO清除劑)處理則抑制了干旱脅迫誘導(dǎo)的抗氧化酶活性,表現(xiàn)出與對(duì)照相近的水平,表明內(nèi)源NO參與了干旱脅迫誘導(dǎo)的抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)。L-NNA(NOS抑制劑)處理顯著地抑制了干旱脅迫下大豆根中SOD、CAT和POD活性;NaN3(NR抑制劑)處理也抑制了干旱脅迫下大豆根中SOD、CAT和POD活性。這些結(jié)果表明,NOS和NR介導(dǎo)的NO產(chǎn)生途徑均參與了干旱脅迫下抗氧化酶活性的調(diào)節(jié),并且NOS途徑起著主導(dǎo)作用。

　　2.3干旱脅迫對(duì)大豆幼苗NO產(chǎn)生的影響

　　為了進(jìn)一步證實(shí)NO參與調(diào)節(jié)了干旱脅迫下抗氧化酶活性的誘導(dǎo),本試驗(yàn)檢測(cè)了干旱脅迫下NO的產(chǎn)生情況。如圖2所示,干旱脅迫下大豆根中NO產(chǎn)生情況與抗氧化酶活性變化趨勢(shì)一致。PEG處理增加了NO的產(chǎn)生,與對(duì)照相比增加了89.3%;PTIO處理則完全抑制了干旱脅迫誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生;L-NNA和NaN3處理均抑制了干旱脅迫下NO產(chǎn)生,與PEG處理相比均顯著降低。這些結(jié)果進(jìn)一步表明,干旱脅迫下NO參與了抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)。