摘 要：為了提高城市尾水中氮的去除率，優(yōu)化篩選出一株好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌，通過(guò)調(diào)整尾水的氨氮濃度，研究其在不同氨氮濃度的尾水中的反硝化能力。結(jié)果表明：好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h的硝化和反硝化能力較強(qiáng)，在24，48 h硝態(tài)氮降解率分別達(dá)到83.1%和91.1%;在氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L的城市尾水中，總氮、氨氮、硝態(tài)氮去除效果最明顯，去除率分別為56.9%，70.2%，91.1%;亞硝態(tài)氮出現(xiàn)累積，累積率為20%;氨氮質(zhì)量濃度為15，25 mg/L條件下，總氮與氨氮去除效果明顯降低;在25 mg/L條件下，亞硝態(tài)去除率增加，硝態(tài)氮去除率不明顯。因此，好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h在氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L的城市尾水中進(jìn)行異養(yǎng)硝化和好氧反硝化作用的效果最好，其在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以去除氨態(tài)氮為主。所采用的細(xì)菌脫氮方法與傳統(tǒng)的生物脫氮相比具有節(jié)約運(yùn)行成本、耐氧性好、平衡p值等優(yōu)勢(shì)，有著廣闊的應(yīng)用前景。

　　關(guān)鍵詞：水污染防治工程;同步硝化;好氧反硝化;城市尾水;氨氮濃度

　　《國(guó)際生物制品學(xué)》(雙月刊)創(chuàng)刊于1973年，由中華醫(yī)學(xué)會(huì)上海生物制品研究所主辦。本刊為公開(kāi)發(fā)行的國(guó)家級(jí)學(xué)術(shù)期刊，主要報(bào)道國(guó)內(nèi)外生物制品學(xué)領(lǐng)域的新動(dòng)態(tài)、新技術(shù)、新進(jìn)展和新經(jīng)驗(yàn)。本刊是我國(guó)最早出版的、在國(guó)內(nèi)生物制品學(xué)界具有重要影響的生物制品學(xué)專(zhuān)業(yè)期刊。

　　傳統(tǒng)的生物脫氮過(guò)程分為硝化(N+4→NO-2→NO-3)和厭氧反硝化(NO-3→NO-2→NO→N2O→N2)兩個(gè)過(guò)程，需要分別在好氧和厭氧條件下完成[1-2]。20世紀(jì)80年代，ROBERTSON等[3]報(bào)道了好氧反硝化細(xì)菌和好氧反硝化酶系的存在，為生物脫氮技術(shù)提供了一種嶄新的思路。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌約50多個(gè)屬，130多個(gè)種，包括了無(wú)色桿菌屬(Achrombacter)、短桿菌屬(Brevibacterium)、蒼白桿菌屬(Ochrobacturum)等[4]。其中環(huán)境中最普遍存在的好氧反硝化細(xì)菌為假單胞菌屬(Pseudomonaceae)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、副球菌屬(Paracoccus)等[5]。與厭氧反硝化細(xì)菌的反硝化相比，好氧反硝化細(xì)菌(多為異養(yǎng)硝化菌)的硝化過(guò)程和反硝化過(guò)程可同時(shí)進(jìn)行，硝化的產(chǎn)物可直接作為反硝化的底物，除去了NO-3和NO-2的積累對(duì)反硝化的抑制作用，提高了生物脫氮的速度，且這個(gè)過(guò)程酸堿相對(duì)平衡，能使p值保持在一定范圍之內(nèi)[6-7]。

　　中國(guó)北方區(qū)域降雨量較小，地表水體的生態(tài)基流匱乏[8-9]，除了短暫的雨季，水源大部分是來(lái)自污水處理廠的尾水。污水處理廠排放的尾水或再生水的水量比較穩(wěn)定，已逐步成為中國(guó)北方區(qū)域河流的主要水源之一，但污水處理廠的尾水氨氮濃度限值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地表水V類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，排入地表水體容易引起水體富營(yíng)養(yǎng)化[10-11]，甚至導(dǎo)致水體黑臭，許多城市內(nèi)河出現(xiàn)了常年性或季節(jié)性的黑臭現(xiàn)象[12-13]。因此，進(jìn)行尾水的深度凈化及河道的生態(tài)修復(fù)，增加地表水體的自?xún)裟芰哂兄匾纳鐣?huì)效益和環(huán)境效益[14-15]。本研究采用篩選的高效好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌進(jìn)行尾水脫氮研究，分析了該菌的反硝化與氮代謝特性，以提高脫氮效率，強(qiáng)化尾水的深度凈化，緩解地表水質(zhì)惡化。

　　1 材料和方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

　　超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)·蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、水浴恒溫振蕩器TZ-82(江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)、電熱鼓風(fēng)干燥箱101型(北京科偉永興儀器有限公司)、人工氣候箱LR-250-GS(廣東省醫(yī)療器械廠)、可見(jiàn)分光光度計(jì)22PC06119(上海棱光技術(shù)有限公司)、手提式壓力蒸汽滅菌器DSX-280B(上海申安醫(yī)療器械廠)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)WFZ UV-2802(上海龍尼柯儀器有限公司)。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

　　菌株分離水樣采自石家莊市橋東污水處理廠A/O工藝的好氧池。

　　1.3 培養(yǎng)基

　　好氧同步硝化-反硝化菌富集培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度g/L)：檸檬酸鈉 3.7，(N4)2SO4 2.0，CaCO3 5.0，K2PO4 1.0，F(xiàn)eSO4·72O 0.4，MgSO4·72O 0.5，NaCl 2.0;在富集培養(yǎng)基中再加入2.5%瓊脂作為固體分離培養(yǎng)基[16]。鑒別培養(yǎng)基：在上述固體分離培養(yǎng)基中加入1 mL的1%(溶于酒精)溴甲基酚藍(lán)。

　　1.4 分析方法

　　氨氮的測(cè)定均采用納氏試劑分光光度法，亞硝酸鹽的測(cè)定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，硝態(tài)氮采用紫外分光光度法，總氮的測(cè)定采用過(guò)硫酸鉀氧化-紫外分光光度法[17]。

　　1.5 菌株分離與純化

　　量取10 mL水樣，放入盛有100 mL滅菌的好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌富集液體搖瓶中，在30 ℃，150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h，取50 mL上清液轉(zhuǎn)接到100 mL新配制的反硝化細(xì)菌富集液體搖瓶中，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次，得到反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)液。將得到的富集培養(yǎng)液在鑒別分離培養(yǎng)基上分線，30 ℃培養(yǎng)72 h。在鑒別培養(yǎng)基上選取藍(lán)色單菌落，在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)4次，挑取單菌落測(cè)定其反硝化能力，選取反硝化效果較好菌株進(jìn)一步研究。

　　1.6 細(xì)菌鑒定

　　細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行鑒定，上游引物27f，下游引物1492r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增總體系為50 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃—5 min，94 ℃—1 min，55 ℃—1 min，72 ℃—1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存[18]。

　　PCR產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司(以下簡(jiǎn)稱(chēng)美吉生物)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)Clustalx2.0比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化使用軟件MEGA 5.05。

　　1.7 實(shí)驗(yàn)用水

　　實(shí)驗(yàn)用水取自石家莊市橋東污水處理廠尾水排放河道洨河三環(huán)橋下，水質(zhì)狀況見(jiàn)表1。為了研究同步硝化-好氧反硝化菌在不同濃度下的脫氮性能，在城市尾水中加入氯化銨調(diào)整其氨氮濃度，濃度梯度為10，15，25 mg/L，通過(guò)添加葡萄糖控制C/N值為6，溫度控制為30 ℃，檢測(cè)好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌在氨氮濃度不同的條件下的脫氮性能。

　　2 結(jié)果和討論

　　2.1 菌株同源性分析

　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)反復(fù)篩選獲得4株好氧同步硝化-反硝化菌株，對(duì)所篩選菌株進(jìn)行測(cè)序，Genebank比對(duì)，得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖1所示。

　　對(duì)圖1分析可知，其中FX1d與FX7h同源性較近，相似度達(dá)到99.6%。FX1d屬于Proteobacteria，Alphaproteobacteria，Rhizobiale，Rhizobiaceae，Sinorhizobium/Ensifer group;FX7h與Proteobacteria，Alphaproteobacteria，Rhodobacterales， Rhodobacteraceae，Paracoccus，相似度達(dá)到99%。ROBERTSON等對(duì)異養(yǎng)-好氧反硝化菌研究發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)菌的硝酸鹽還原酶不需要誘導(dǎo)，其反硝化途徑是組成型的，而且證實(shí)了無(wú)論培養(yǎng)基中有無(wú)硝酸鹽，都不會(huì)影響其硝酸鹽還原酶的活性[19]。FX2h與Alphaproteobacteria，Rhodobacterales，Rhodobacteraceae 相似度較高，為99%，表明該菌屬于α-變形菌門(mén)、紅球菌綱、紅球菌科，F(xiàn)X0h屬于球菌目的節(jié)桿菌科。

　　2.2 菌株對(duì)硝態(tài)氮的代謝能力

　　為了達(dá)到更好的反硝化效果，對(duì)4株好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌的氮代謝特征進(jìn)行研究，結(jié)果如圖2所示。

　　由圖2可以看出，培養(yǎng)基中，菌株FX7h與FX2h對(duì)硝態(tài)氮的降解率相對(duì)較高，2株菌都屬于紅球菌科，F(xiàn)X7h白色細(xì)菌在24，48 h硝態(tài)氮降解率達(dá)到83.1%和91.1%。FX2h淡紅色細(xì)菌的硝態(tài)氮降解率在24，48 h達(dá)到81.4%和88.5%。其余2株菌FX0h與FX1d降解硝態(tài)氮的效率較低，因此菌株FX7h為最佳脫氮菌株。本研究選取脫氮效果最好的好氧同步硝化-反硝化菌株FX7h作為研究對(duì)象。其形態(tài)與革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌株呈淡紅色、邊緣整齊，菌落為圓形，表面光滑，不透明。

　　2.3 在不同氨氮濃度的城市尾水中的脫氮效果

　　研究FX7h在不同氨氮濃度條件下的氮代謝特征，結(jié)果如圖3—圖5所示。

　　如圖3所示，總氮濃度逐漸降低，在開(kāi)始時(shí)質(zhì)量濃度為18 mg/L，60 h后減少為7.8 mg/L，總氮的去除率達(dá)到56.9%。氨氮質(zhì)量濃度也由原來(lái)的10.6 mg/L降為4.04 mg/L，氨氮去除率達(dá)到70.2%。硝態(tài)氮去除效果最為明顯，去除率高達(dá)91.1%。由圖3可以看出，亞硝態(tài)氮逐漸升高，質(zhì)量濃度由開(kāi)始時(shí)的0.14 mg/L積累到0.43 mg/L，亞硝態(tài)氮的累積率達(dá)到20%。這表明好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h在氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，對(duì)總氮、氨氮的去除效果明顯，對(duì)硝態(tài)氮有較好的去除效果，同步硝化效果明顯，氨氮去除過(guò)程中，部分氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮，由于對(duì)亞硝態(tài)氮的反硝化速率小于亞硝化速率，亞硝態(tài)氮出現(xiàn)積累，但對(duì)硝態(tài)氮的反硝化速率大于硝態(tài)氮的合成速率，表明該菌在該濃度下有較好的反硝化效果。

　　由圖4 可以看出，同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h對(duì)總氮和氨氮均有去除效果，60 h后總氮的質(zhì)量濃度從開(kāi)始的18.2 mg/L降至10.7 mg/L，氨氮質(zhì)量濃度由原來(lái)的15.9 mg/L降至7.8 mg/L，該菌對(duì)總氮和氨氮的去除率分別為40.9%和50.7%，比在氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L的條件下總氮和氨氮的去除率明顯下降，表明氨氮濃度的增減抑制了好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h的活性，降低了該菌對(duì)總氮和氨氮的去除效率。硝態(tài)氮的質(zhì)量濃度由開(kāi)始時(shí)的0.81 mg/L降至0.31 mg/L;開(kāi)始時(shí)，在12 h時(shí)硝態(tài)氮濃度增加，主要由于氨氮濃度的增加，好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h 開(kāi)始時(shí)溶解氧濃度較高，氨氮濃度較高，硝化效果較好，硝化速率大于反硝化速率，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，溶解氧大量被消耗，濃度降低，硝化速率逐漸降低，反硝化速率大于硝化速率，硝態(tài)氮濃度降低，IN等[20]的研究也出現(xiàn)了這樣的結(jié)果。亞硝態(tài)氮在氨氮質(zhì)量濃度為15 mg/L的條件下，濃度逐漸增加，從開(kāi)始時(shí)的014 mg/L，60 h后升至0.44 mg/L，累積率達(dá)到207%，比氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L條件下的累積率變化更為不明顯，表明氨氮濃度的增加，對(duì)好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h的影響不明顯。

　　由圖5 可以看出，總氮和氨氮的濃度明顯降低，總氮質(zhì)量濃度從開(kāi)始時(shí)的38.2 mg/L，60 h后降低為26.2 mg/L，降解率為31.5%;氨氮質(zhì)量濃度由原來(lái)的25.4 mg/L降低為13.4 mg/L，降解率為47%，表明好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h在氨氮質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，對(duì)總氮和氨氮去除均有效果，相比于低濃度氨氮條件下，總氮與氨氮的降解率明顯下降，表明氨氮濃度的增加使好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h對(duì)總氮和氨氮的去除率降低。圖5顯示在氨氮質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，硝態(tài)氮的去除效果不明顯，表明好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h在該條件下反硝化效率較低。亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度降低，從開(kāi)始時(shí)的0.75 mg/L，60 h后降低為0.42 mg/L，亞硝態(tài)氮的去除效率為44%，表明在氨氮質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，由于氨氮濃度增加，促進(jìn)了亞硝態(tài)氮的去除，表明該菌代謝亞硝態(tài)氮的能力更強(qiáng)。

　　以上對(duì)細(xì)菌FX7h代謝特征的分析表明，在氨氮質(zhì)量濃度為25 mg/L時(shí)，總氮、氨氮質(zhì)量濃度明顯降低，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度也出現(xiàn)降低，硝態(tài)氮去除效果變化不明顯，各形態(tài)氮沒(méi)有出現(xiàn)積累，這與SUN等[21]報(bào)道的好氧反硝化菌株T13脫氨態(tài)氮的結(jié)果一致。氨氮質(zhì)量濃度分別為10 mg/L和15 mg/L時(shí)，亞硝態(tài)氮有明顯的積累，氨氮、硝態(tài)氮質(zhì)量濃度減小，該結(jié)果與CEN等[22]研究的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株CPZ24相似，與LIANG等[23]報(bào)道的好氧反硝化細(xì)菌Paracoccus denitrificans DL-23脫氮特征一致。以上研究表明，具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力的不同菌株脫氨態(tài)氮的方式具有不同特征。

　　3 結(jié) 語(yǔ)

　　1)確定了從城市污水中優(yōu)選的1株好氧同步硝化-反硝化菌株FX7h，該菌為紅球菌屬(Rhodococcus sp.);

　　2)好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌FX7h在氨氮質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，對(duì)總氮、氨氮的去除效果明顯，對(duì)硝態(tài)氮有較好的去除效果，同步硝化效果明顯，隨著氨氮濃度的升高，總氮、氨氮、硝態(tài)氮的去除率逐漸降低;

　　3)細(xì)菌FX7h對(duì)總氮和氨氮有較好的去除效果，在不同濃度氨氮條件下，該菌以去除氨氮為主。

　　4)好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，為生物脫氮提供了一種嶄新的思路，具有重要的應(yīng)用前景。該細(xì)菌能夠在有氧條件下去除受污染水體中的氮素，具有同步硝化-反硝化的能力。在污水處理中，有氧條件下，硝化和反硝化反應(yīng)可以在一個(gè)工段中同時(shí)進(jìn)行，這將大幅度減少土地和資金的需求及管理難度。因此，進(jìn)一步對(duì)好氧同步硝化-反硝化細(xì)菌在高鹽分、低溫等極端環(huán)境下的氮素去除進(jìn)行研究是下一步的研究方向。

　　參考文獻(xiàn)/References：

　　[1] TAKENAKA S， ZOU Q， KUNTIYA A， et al. Isolation and characterization of thermotolerant bacterium utilizing ammonium and nitrate ions under aerobic conditions. Biotechnology Letters， 2007， 29(3)： 385-390.

　　[2] KARDENAVIS A A， KAPLEY A， PUROIT . Simultaneous nitrification and denitrification by diverse Diaphorobacter sp.. Applied Microbiology and Biotechnology， 2007， 77(2)： 403-409.