摘要：【目的】明確草魚Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號通路基因在防御多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)感染過程中的免疫作用，為有效防控魚類多子小瓜蟲感染提供理論參考。【方法】以多子小瓜蟲感染草魚后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測分析在不同時(shí)間點(diǎn)(感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d)草魚部分TLRs基因(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接頭蛋白基因(MyD88和TRIF)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(IRAK4和IRAK1)及細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮膚和脾臟中的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化?！窘Y(jié)果】草魚感染多子小瓜蟲后，TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮膚和脾臟中的表達(dá)主要呈上調(diào)趨勢，TLR4基因在皮膚中主要呈上調(diào)表達(dá)，在脾臟中則主要呈下調(diào)表達(dá);TLR信號通路接頭蛋白基因MyD88和TRIF的表達(dá)變化趨勢明顯不同，其中，MyD88基因的表達(dá)在感染后第1～3 d均呈顯著上調(diào)趨勢(P<0.05，下同)，而TRIF基因的表達(dá)在整個(gè)試驗(yàn)過程中絕大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)與對照組無顯著差異(P>0.05);IRAK4和IRAK1在皮膚和脾臟中的表達(dá)也主要呈上調(diào)趨勢，但在脾臟中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表達(dá)呈顯著下調(diào)趨勢;IL-1β和TNF-α在絕大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào)，但I(xiàn)FN的表達(dá)基本沒有變化?！窘Y(jié)論】草魚TLR信號通路中的部分TLRs基因(TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接頭蛋白基因(MyD88)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(IRAK4和IRAK1)及下游細(xì)胞因子(IL-1β和TNF-α)均參與防御多子小瓜蟲感染的免疫反應(yīng)，尤其是在感染早期和中期發(fā)揮關(guān)鍵作用。

　　關(guān)鍵詞： 草魚;多子小瓜蟲;Toll樣受體(TLR);信號通路;基因表達(dá)

　　引言

　　【研究意義】Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)屬于I型跨膜蛋白，是一類重要的模式識別受體，能特異性識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，并通過募集接頭蛋白、轉(zhuǎn)導(dǎo)信號及誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子等表達(dá)而發(fā)揮免疫防御作用，既是機(jī)體的第一道天然屏障，也是連接先天性免疫和獲得性免疫的重要橋梁(何玉潔和潘建平，2017)。因此，研究TLR信號通路基因在病原感染過程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)，對揭示病原和魚類間的免疫互作機(jī)制及制定有效的防控措施具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】依據(jù)接頭蛋白的不同哺乳動(dòng)物TLR信號通路可分為髓系分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴型和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR domain-containing adaptor-inducing IFN-β，TRIF)依賴型(Yuk and Jo，2011)。TLRs在識別相應(yīng)的PAMPs后，除TLR3外，其他TLRs均以MyD88為接頭蛋白，然后招募白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶4(IL-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4)和IRAK1，再將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)，TRAF6與轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)及其結(jié)合蛋白(TAK1-binding proteins，TABs)TAB1和TAB2組合成復(fù)合物，從而激活下游的NF-κB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)免疫因子表達(dá)，最終啟動(dòng)免疫防御反應(yīng)(Jiménez-Dalmaroni et al.，2016)。其中，TLR2和TLR4識別細(xì)菌的脂肽和脂多糖等;TLR3識別病毒的雙鏈RNA;TLR5識別細(xì)菌的鞭毛蛋白;TLR7和TLR8識別病毒的單鏈RNA;TLR9識別非甲基化的CpG-DNA(Tan and Kagan，2017)。目前，有關(guān)TLRs與寄生蟲感染的相關(guān)性研究仍較少，僅發(fā)現(xiàn)TLR2或TLR4可識別利什曼原蟲(Leishmania major)(Bec-ker et al.，2003)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)(Debierre-Grockiego et al.，2007)和惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)(Zhu et al.，2011)的糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定蛋白;TLR9可識別克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)非甲基化的DNA(Bafica et al.，2006);TLR11能識別剛地弓形蟲的Profilin-like蛋白(Yaro-vinsky et al.，2005)等。至今，已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)15種TLRs，而從魚類中至少鑒定出20種TLRs(范澤軍等，2015)。針對魚類的研究主要集中在TLRs與細(xì)菌或病毒感染的相關(guān)性方面(Liao et al.，2017)。Li等(2011a，2011b，2012，2016)研究發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)的TLR2、TLR9、TLR21、MyD88及IRAK1等廣泛參與抵御刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)感染的免疫反應(yīng)，表明魚類TLR信號通路基因在防御寄生蟲的感染過程中發(fā)揮重要作用。【本研究切入點(diǎn)】多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)是一種廣泛分布的纖毛類寄生性原蟲，幾乎可感染全部淡水魚類，引起小瓜蟲病(俗稱白點(diǎn)病)，導(dǎo)致魚類死亡或引起細(xì)菌、病毒等繼發(fā)性感染，而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(宋飛彪等，2012;趙飛等，2012)。草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國最重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類之一，約占淡水魚總產(chǎn)量的20%，但草魚養(yǎng)殖一直深受小瓜蟲病困擾。早期研究發(fā)現(xiàn)，草魚的TRAF6、TAK1、TAB1和TAB2及斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的TLR1、TLR2、TLR9和TLR21等TLR信號通路基因參與了抵御多子小瓜蟲感染的免疫應(yīng)答(Zhao et al.，2013a，2013b，2014)，但草魚TLR信號通路其他基因是否參與并發(fā)揮防御多子小瓜蟲感染作用等機(jī)理尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以多子小瓜蟲感染草魚后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測分析草魚的部分TLRs(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接頭蛋白(MyD88和TRIF)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(IRAK4和IRAK1)及細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮膚和脾臟中的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化，明確草魚TLR信號通路基因在防御多子小瓜蟲感染過程中的免疫作用，為有效防控魚類多子小瓜蟲感染提供理論參考。

　　1 材料與方法

　　1. 1 試驗(yàn)材料

　　草魚購自廣東省佛山市某養(yǎng)殖場，健康活潑，規(guī)格整齊，體重約50 g/尾，在養(yǎng)殖過程中未感染過多子小瓜蟲。隨機(jī)挑取10尾草魚，鏡檢魚鰓和體表均未發(fā)現(xiàn)多子小瓜蟲或其他寄生蟲。草魚在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的循環(huán)流水養(yǎng)殖箱中暫養(yǎng)2周，氧氣充足，水溫控制在(23±1)℃，每日定時(shí)投喂商品飼料2次。多子小瓜蟲從患病草魚上分離獲得，采用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的以斑點(diǎn)叉尾鮰為宿主的室內(nèi)傳代系統(tǒng)進(jìn)行保種傳代(Zhao et al.，2013a，2013b，2014)。

　　1. 2 多子小瓜蟲幼蟲準(zhǔn)備

　　在多子小瓜蟲傳代過程中將體表已顯現(xiàn)白點(diǎn)的斑點(diǎn)叉尾鮰置于5 L的塑料燒杯中，發(fā)育成熟的包囊將從魚體上自動(dòng)脫落，分別用孔徑250和75 μm的網(wǎng)篩過濾、收集包囊。將包囊輕輕洗凈后轉(zhuǎn)入1 L的玻璃燒杯中，添加少量無菌水，23 ℃孵化20 h即發(fā)育成幼蟲，再以孔徑40 μm的網(wǎng)篩過濾，得到活體幼蟲濾液。取10份10 μL的幼蟲濾液，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，換算出總濾液中的多子小瓜蟲活體幼蟲數(shù)量，用于后續(xù)的草魚感染試驗(yàn)。

　　1. 3 感染試驗(yàn)

　　將120尾草魚隨機(jī)平均分成感染組和對照組。感染組的60尾草魚置于60 L的水桶中，按1∶10000的感染劑量加入多子小瓜蟲活體幼蟲進(jìn)行體表感染，感染2 h后將草魚轉(zhuǎn)至250 L的魚缸中。采用相同方法處理對照組的60尾草魚，但不添加多子小瓜蟲幼蟲。于感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d時(shí)分別從感染組和對照組隨機(jī)取樣6尾草魚。以滅菌刀片刮去草魚背部中央的鱗片，使用尖頭鑷子剝離1.0 cm×1.5 cm大小的皮膚，輕輕刮除皮膚內(nèi)側(cè)肌肉以得到干凈的背部皮膚，液氮速凍后-70 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)快速采集脾臟凍存?zhèn)溆谩?/p>

　　1. 4 總RNA提取及cDNA合成

　　采用TRIzol試劑盒(Invitrogen公司)提取草魚皮膚和脾臟組織的總RNA，以Nanodrop 1000微量紫外分光光度計(jì)(Thermo公司)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。使用RNase-free DNase I(Fermentas公司)去除基因組DNA后，按ReverTra Ace@ Reverse Transcriptase試劑盒(TOYOBO公司)說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)程序：42 ℃ 20 min;99 ℃ 5 min;4 ℃ 5 min。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1. 5 目的基因片段克隆及測序分析

　　采用Beacon Designer 8.0設(shè)計(jì)草魚TLR信號通路基因的特異性引物(表1)。以草魚脾臟cDNA為模板進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25.00 μL：cDNA模板1.00 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.00 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2.50 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.00 μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用E.Z.N.A? Gel Extraction Kit(OMEGA公司)進(jìn)行目的條帶回收純化，然后TA克隆至pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。取100.00 μL菌液凃布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選3個(gè)菌落PCR驗(yàn)證呈陽性的克隆送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序。

　　1. 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測分析

　　采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測感染多子小瓜蟲后草魚皮膚和脾臟組織中TLR信號通路基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)，以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組織的cDNA為模板、β-action為內(nèi)參基因，在Roche LightCycler480 Real-time PCR Detection System上進(jìn)行定量檢測分析。反應(yīng)體系10.00 μL：cDNA模板0.40 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.40 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5.00 μL，ddH2O 3.80 μL。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)采集1次熒光信號。采用2-△△Ct法(Livak and Schmittgen，2001)計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，并以SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

　　2 結(jié)果與分析

　　2. 1 感染多子小瓜蟲后草魚TLRs基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

　　2. 1. 1 TLR1和TLR2基因的表達(dá)動(dòng)態(tài) 草魚感染多子小瓜蟲后，其皮膚和脾臟的TLR1和TLR2基因表達(dá)主要呈上調(diào)趨勢(表2)。在感染后第12 h，TLR1基因在皮膚中開始顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05，下同)，是對照組的3.02倍，至感染后第1和2 d持續(xù)上調(diào)至對照組的5.38和6.31倍;在脾臟中，TLR1基因在感染后第2和3 d時(shí)分別上調(diào)2.49和4.69倍，在其他時(shí)間點(diǎn)與對照組間無顯著差異(P>0.05，下同)。TLR2與TLR1基因的表達(dá)變化相似，在皮膚中表現(xiàn)為感染后第1～3 d均顯著上調(diào)，于感染后第3 d達(dá)峰值，為對照組的4.35倍;在脾臟中表現(xiàn)為感染后第2和3 d顯著高于對照組，分別是對照組的2.89和5.69倍。

　　2. 1. 2 TLR4基因的表達(dá)動(dòng)態(tài) 草魚感染多子小瓜蟲后，TLR4基因在其皮膚和脾臟中的表達(dá)變化趨勢不同(表2)。在皮膚中，TLR4基因在感染后第12 h上調(diào)為對照組的2.82倍，但至感染后第1 d回落到對照組水平，隨后其表達(dá)又逐漸上調(diào)，于感染第3 d達(dá)峰值(4.55倍)。而在脾臟中，TLR4基因在感染后第12 h和第1 d的表達(dá)量顯著下調(diào)，僅為對照組的35%和25%;在其他時(shí)間點(diǎn)與對照組間均無顯著差異。

　　2. 1. 3 TLR9基因的表達(dá)動(dòng)態(tài) 草魚感染多子小瓜蟲后，其皮膚中的TLR9基因在感染后第2、3和7 d均呈顯著上調(diào)表達(dá)，于感染后第3 d達(dá)峰值(3.35倍);而在脾臟中，TLR9基因除在感染第1 d顯著上調(diào)2.45倍和感染后第3 d顯著下調(diào)39%外，其他時(shí)間點(diǎn)與對照組間均無顯著差異(表2)。

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