摘 要：初步探究凹線仙女蜆的系統(tǒng)發(fā)育地位，為凹線仙女蜆的分子遺傳學研究提供前期數(shù)據(jù)。采用PCR方法擴增得到凹線仙女蜆Cyrenobatissa subsulcata線粒體細胞色素b(Cytb)基因片段序列，序列長為624 bp，并在NCBI上使用NT數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，進而構建系統(tǒng)進化樹，探討凹線仙女蜆的分類地位。結果顯示NT數(shù)據(jù)庫中未見凹線仙女蜆的Cytb基因信息。研究擴增獲得的序列與蜆屬其他種的Cytb基因片段有88%的相似性，與其他簾蛤目貝類的相似度77.02%～78.53%，表明擴增出的片段是凹線仙女蜆所特有的Cytb基因片段。基于Kimura′s 2-Parameter模型計算得出，3個樣本個體的遺傳距離僅為0～0.0016，遠小于蜆屬內(nèi)種間遺傳距離(0.002～0.114)，與蜆屬的遺傳距離為0.127～0.144、與簾蛤目簾蛤科種類遺傳距離為0.282～0.335。進化樹顯示，凹線仙女蜆樣品獨立聚為一支，與蜆屬聚為一大支，支持度為99，表明仙女蜆屬與蜆屬的親緣關系較近，與簾蛤科的遺傳距離較遠。

　　關鍵詞：凹線仙女蜆;Cytb基因片段;進化樹;遺傳距離

　　凹線仙女蜆Cyrenobatissa subsulcata隸屬于軟體動物門Mollusca、雙殼綱Bivalvia、異齒亞綱Heterodonta、簾蛤目Veneroida、蜆科Corbiculidae、仙女蜆屬Cyrenobatissa。凹線仙女蜆是中國的地方性物種，分布具有局限性，主要棲息于底質為沙或沙泥的咸淡水交匯處，主要分布于廣東省(汕頭韓江、吳川鑒江)、廣西省(防城)、海南省(排港)和臺灣省(淡水、蘇澳、安平)[1]。蜆科種類在沿海河口半咸水區(qū)域也有較多分布，硬殼蜆屬的紅樹蜆Polymesoda erosa分布于中國、菲律賓等地區(qū)，我國主要分布于廣東省、廣西省、海南省、臺灣地區(qū)等[2];花蜆屬的花蜆Cyrenodonax formosana分布于河口砂質區(qū)，產(chǎn)于我國臺灣地區(qū)(淡水)、福建省(云霄)和廣西省(防城)[3];蜆屬的河蜆廣泛分布于江河、湖泊、溝渠及咸淡水交匯處等水域，在福建省的閩江、烏龍江地區(qū)有百年的養(yǎng)殖歷史，是河口底棲生物的重要組成部分和重要的經(jīng)濟貝類[4-5]。

　　凹線仙女蜆的研究主要在分類學和生態(tài)學[6]，對河蜆Corbicula fluminea等蜆科物種研究較多，包括生態(tài)特性、遺傳差異分析、生長與繁殖等方面[7-9]。凹線仙女蜆是蜆科中個體最大的物種，具有較高的經(jīng)濟價值[6]。蜆的軟體部含有較低的脂肪、較高的蛋白質，蜆肉酶解產(chǎn)物具有解酒護肝的功效，可食用也可作為天然調(diào)味品，具有較高的營養(yǎng)價值[10]。由于過度捕撈等一系列對自然環(huán)境的不合理利用問題，造成河流生態(tài)系統(tǒng)結構破壞、生物多樣性驟減和生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力下降，有些地區(qū)的蜆類已處于瀕危狀態(tài)，制約了蜆類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[11-13]。因此，對凹線仙女蜆種質資源的保護、利用研究已顯得十分緊迫。物種的分子鑒定是種質資源研究的重要基礎，細胞色素b基因(Cytb)作為一種線粒體DNA分子標記，其結構和功能是線粒體DNA的13個蛋白質編碼基因中了解最清楚的基因，已廣泛用于魁蚶Scapharca broughtonii、鰱Hypophthalmichthys molitrix、松江鱸Trachidermus fasciatus和河蜆Corbicula fluminea等水生物種的分子鑒定、種間變異程度和親緣關系、不同地理群體遺傳多樣性和遺傳結構等研究[14-19]，但目前尚未見凹線仙女蜆線粒體基因研究的相關報道。

　　本研究以分布于福州市長樂區(qū)凹線仙女蜆群體為研究對象，對其Cytb基因片段進行擴增分析，探討Cytb基因片段作為凹線仙女蜆種類鑒定的分子標記的可行性，可為凹線仙女蜆的遺傳多樣性、種質資源研究提供基礎資料。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　1.1.1 凹線仙女蜆樣本信息 凹線仙女蜆Cyrenobatissa subsulcata個體全部取自福州市長樂區(qū)文武砂鎮(zhèn)規(guī)劃中的濱海新區(qū)濕地公園(圖1)。

　　1.1.2 試驗儀器 PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、Nanodrop分光光度計、體視熒光顯微鏡、電泳儀、解剖鏡。

　　1.1.3 試驗試劑 蛋白酶K、Quick-DNA Universal Kit 試劑盒(Zymo Research生物科技公司)、瓊脂糖(Sigma-Aldrich)、引物(福州擎科生物技術有限公司合成)、 DNA marker(Thermo Scientific)、 PCR mixture(北京全式金生物技術有限公司)。

　　1.2 試驗方法

　　1.2.1 形態(tài)學性狀測定 從采集來的凹線仙女蜆中隨機挑選30個，將貝殼表面的水分吸干后，用游標卡尺測量仙女蜆的殼長、殼高、殼寬，精確到0.01 mm。用電子天平測量活體的軟體重、殼重、總重精確到0.01 g。凹線仙女蜆的外部形態(tài)見圖2。

　　1.2.2 凹線仙女蜆基因組DNA的提取 采用Quick-DNA Universal Kit試劑盒提取基因片段，在所選的30個凹線仙女蜆中隨機挑選3個個體，分別提取，每個個體取0.1 g的肌肉組織放入EP管，剪碎后加入95 μL無菌水、95 μL Solid Tissue Buffer(blue)和10 μL蛋白酶K。將EP管放入55℃的水浴鍋中水浴1.5 h。當組織溶解后，12000 r·min-1離心10 min，取上層液150 μL，移入新的EP管，加300 μL的Genomic Binding Buffer溶液混合均勻。混合液轉入Zymo-spin IIC-xl小管中，12000 r·min-1離心1 min，棄掉下管的液體。再加 400 μL的DNA pre-wash Buffer到小管，12000 r·min-1離心1 min。然后加700 μL的g-DNA wash Buffer液體到小管，12000 r·min-1速度下離心1 min，棄掉下管的液體。最后加入37 μL雙蒸水。12000 r·min-1離心1 min后得到DNA溶液，之后進行電泳，并用Nanodrop測定DNA完整度和純度。

　　1.2.3 凹線仙女蜆Cytb基因片段的克隆和序列測定 Cytb基因引物設計參考Yamada等[20]，序列擴增通用引物為CBF6(5′GCAAGCTTTTGATTCTGTTGTTCACATTG3′)和CBR6(5′GTAGGAATCCTACGCAAAATGAGAATAAGCG3′ )。據(jù)梯度PCR確定最適溫度57℃，在此溫度下進行PCR產(chǎn)物的大體系擴增。PCR 100 μL體系如下：模板DNA 2 μL、上下游引物1 μL、2×PCR mixture 50 μL和無菌水46 μL。分別以3只凹線仙女蜆基因組DNA作模板，放入PCR儀擴增。擴增程序為：預變性94℃ 7 min，變性94℃ 1 min，復性57℃ 45 s，72℃延伸2 min，擴增35個循環(huán)結束后，72℃再延伸7 min。預期擴增片段大小640 bp，將PCR產(chǎn)物進行1%的凝膠電泳，選擇亮度完好、有特異性條帶的PCR產(chǎn)物送到尚亞生物公司測序。

　　1.3 數(shù)據(jù)分析

　　運用Excel對形態(tài)學數(shù)據(jù)進行初步處理，計算變異系數(shù)。利用Mega7軟件將本研究得到的基因片段在NCBI上使用NT數(shù)據(jù)庫進行Blast比對和序列信息分析。運用Mega7軟件內(nèi)Clustal W進行多序列比對，并輔以人工校對，計算出凹線仙女蜆Cytb基因片段序列長度以及堿基組成;通過Kimura′s 2-Parameter模型計算出凹線仙女蜆與蜆屬的其他種Cytb基因片段序列的遺傳距離;通過Maximum Likelihood方法對凹線仙女蜆Cytb基因片段進行分子進化樹的構建。

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