摘要：明確對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌侵染毒力的影響，可為克服三七連作障礙提供有效的策略。結(jié)合熒光素二乙酸酯-碘化丙啶(FDA-PI)染色及馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板萌發(fā)法，分析不同濃度下對羥基苯甲酸與尖孢鐮刀菌孢子活性的相關(guān)性;采用酶學(xué)法分析不同濃度下對羥基苯甲酸對真菌纖維素酶分泌的影響。FDA-PI染色結(jié)果表明，當(dāng)對羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時，尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢數(shù)量最多，孢子活性最強。PDA平板萌發(fā)測定結(jié)果顯示，對羥基苯甲酸濃度為1mmol/L時，尖孢鐮刀菌孢子的平均萌發(fā)率為58.05%，孢子萌發(fā)率最高。低濃度的對羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌分泌的纖維素酶活性增加，而高濃度下降低;對羥基苯甲酸濃度為5mmol/L時，纖維素酶活性最高，峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)4d時，達(dá)到1.57U/mL，是相同時間下對照的5.6倍。研究表明，低濃度對羥基苯甲酸(1～5mmol/L)脅迫有利于尖孢鐮刀菌孢子生長，且提高其分泌的纖維素酶活性。

　　關(guān)鍵詞：對羥基苯甲酸;尖孢鐮刀菌;孢子活性;纖維素酶

　　作者：趙靜

　　通信：王志遠(yuǎn)

　　三七根腐病是三七生產(chǎn)中的一類重要病害，不僅影響三七產(chǎn)量，更影響三七質(zhì)量，其中以鐮刀菌型根腐病最為多見[1]。在三七栽培中，隨著連作年限的延長根腐病發(fā)病率明顯增加[2]。根腐病的發(fā)生與連作條件下植物根系分泌物對病原菌的化感作用有密切關(guān)系。研究三七根系分泌物對病菌的化感致病性是解析連作條件下根腐病形成機制的有效途徑。

　　在植物的生長發(fā)育過程中，根系作為植物與土壤的接觸部分，不僅從土壤中吸收水分和養(yǎng)分，還通過分泌的方式向周圍釋放一些無機離子和有機化合物，這些物質(zhì)是一類復(fù)雜的混合物，是植物連作對根際土壤微生物產(chǎn)生影響的重要媒介之一，參與植物與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換與信號傳遞，是根際最為重要的營養(yǎng)和能量來源，也是構(gòu)成植物不同根際微生態(tài)特征的關(guān)鍵因素[3-5]。對羥基苯甲酸為酚酸類化感物質(zhì)，是自然界中常見的化合物，存在于高等植物、微生物、苔蘚和土壤中。酚酸類物質(zhì)是導(dǎo)致作物產(chǎn)生連作障礙的主要因素，它可以直接或間接地促進(jìn)或抑制微生物生長，進(jìn)而影響作物生長。Ren等研究了叢枝菌根定殖是否能緩解西瓜枯萎病，改變植物對病原菌的反應(yīng)，結(jié)果表明，叢枝菌根的侵染抑制了西瓜根和根際病原菌的生長，使病害指數(shù)降低了89.3%，這是因為叢枝菌根的侵染改變了根系分泌物，抑制了西瓜枯萎病菌孢子的萌發(fā)[6]。郝文雅等以不同抗性西瓜品種以及化感水稻品種為試驗對象，對其根系分泌物中可溶性糖和游離氨基酸的含量和組成進(jìn)行分析，并研究了氨基酸對西瓜?；图怄哏牭毒L的影響，結(jié)果表明，西瓜的根系分泌物能夠促進(jìn)鐮刀菌孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢，而水稻根系分泌物卻具有反向作用[7]。

　　本研究擬探究對羥基苯甲酸脅迫下尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特性及致病毒力，以探明對羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌的化感作用，以期為連作條件下根腐病的發(fā)生及病害防治提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1試驗菌株及試驗時間

　　尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)重點實驗室惠贈。試驗于2019年在玉溪師范學(xué)院分子生物學(xué)實驗室進(jìn)行。

　　1.2孢子活性的檢測

　　1.2.1孢子懸浮液的制備

　　將尖孢鐮刀菌菌株分別在含有1、5、10、50mmol/L對羥基苯甲酸的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中于26℃下振蕩培養(yǎng)7d，以不添加對羥基苯甲酸的PDA培養(yǎng)基為對照(CK)。將培養(yǎng)好的病原菌孢子混合液依次用200目(孔徑0.075mm)和300目(孔徑0.048mm)篩網(wǎng)過濾，去除菌絲和培養(yǎng)基雜質(zhì)。然后取30mL濾液于50mL離心管中，在5000r/min下離心5min，去上清液后以無菌水進(jìn)行重懸并離心，重復(fù)2～3次。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH值為7.4)將孢子重懸。

　　1.2.2FDA-PI熒光染液的配制、染色及孢子死亡率的計算

　　熒光素二乙酸酯-碘化丙啶(FDA-PI)熒光染液的配制及染色參照柴阿麗等的方法[8]，尖孢鐮刀菌孢子懸浮液染色后于熒光顯微鏡下觀察，采用血細(xì)胞計數(shù)器根據(jù)孢子著色情況計算孢子死亡率。

　　1.3孢子萌發(fā)率的計算

　　制備對羥基苯甲酸濃度分別為1、5、10、50mmol/L的PDA培養(yǎng)基，以不添加對羥基苯甲酸的PCA培養(yǎng)基為對照(CK)。把滅過菌的微孔濾膜平鋪在制備好的PDA平板上，使微孔濾膜平鋪于培養(yǎng)基表面，把制備的孢子懸浮液平鋪在濾膜上，用三角玻璃棒將菌懸液涂布均勻(每個平板涂布70μL菌懸液)，用封口膜封口后置于28℃下培養(yǎng)，5～8h后制作玻片觀察并記錄孢子的萌發(fā)情況，每個處理重復(fù)3次，每個樣本檢查100個孢子，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。

　　1.4酶活性的測定

　　纖維素酶活性的測定采用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)法。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1FDA-PI熒光染色效果觀察和孢子死亡率的計算

　　尖孢鐮刀菌新鮮孢子懸浮液利用FDA染液單染后，在熒光顯微鏡下，活孢子呈亮綠色熒光(圖1-a);經(jīng)加熱致死的孢子利用PI染液單染后，死孢子發(fā)出紅色熒光(圖1-b)。取1mL新鮮孢子懸浮液與1mL[JP+1]加熱致死的孢子懸浮液混合均勻，經(jīng)FDA-PI染液染色后，在熒光顯微鏡下可明顯觀察到發(fā)出紅色熒光的死孢子和發(fā)出綠色熒光的活孢子(圖1-c)。上述結(jié)果表明，采用FDA-PI染色方法能較好地對尖孢鐮刀菌孢子的死活進(jìn)行判斷，其中活孢子呈綠色熒光，死亡孢子呈紅色熒光。

　　推薦閱讀：生物學(xué)通報生物工程師論文