摘 要 以胡桃楸的成熟合子胚為外植體，采用不同消毒方式和培養(yǎng)方式進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，分析了污染率和愈傷組織誘導(dǎo)率。結(jié)果表明：紫外線直射15 min滅菌效果最好，污染率及褐化率均最低，分別為15.82%和22.93%;暗培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)利于愈傷組織的誘導(dǎo)，以15 d左右為佳。

　　關(guān)鍵詞 胡桃楸;外植體;誘導(dǎo);愈傷組織

　　胡桃楸(Juglans mandshurica)屬胡桃科胡桃屬的落葉喬木，在我國(guó)北方地區(qū)是一類(lèi)果材兼具用珍貴樹(shù)種，果實(shí)具有很高的食用價(jià)值，營(yíng)養(yǎng)豐富，根莖葉有很高的藥用價(jià)值，木材性狀優(yōu)良，在家具等行業(yè)也得到廣泛應(yīng)用。由此可知胡桃楸的栽植應(yīng)用前景廣闊。胡桃楸傳統(tǒng)育苗方式主要采取播種繁殖，其種子具有深度休眠的特性，此種繁殖方法存在需要對(duì)休眠的種子進(jìn)行處理且后代無(wú)法持續(xù)地將母樹(shù)優(yōu)良性狀保存下來(lái)等問(wèn)題，因此，發(fā)展無(wú)性繁殖方式優(yōu)越性更加明顯。

　　目前，胡桃楸無(wú)性繁殖方式中采取的主要方式是組織培養(yǎng)、扦插等，學(xué)者對(duì)胡桃楸的扦插[1，2]、組織培養(yǎng)[3，4]方面開(kāi)展了一系列的研究，相對(duì)來(lái)說(shuō)組織培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)更加明顯，需要的空間小，不受到時(shí)間的限制，具有較大的擴(kuò)繁系數(shù)，因此，本研究選擇組織培養(yǎng)的方法，外植體選擇成熟的合子胚，經(jīng)過(guò)消毒、培養(yǎng)預(yù)處理后進(jìn)行不定芽萌發(fā)效果的研究，為胡桃楸不定芽誘導(dǎo)植株再生體系的建立、實(shí)現(xiàn)育種技術(shù)的改良等方面提供一定的基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

　　試驗(yàn)所需種子采集于遼寧省凌源市青龍河國(guó)家自然保護(hù)區(qū)，地理坐標(biāo)為18°51′58″—119°09′39″ E，40°46′21″—40°53′02″ N，處于凌源市的燕山東段暖溫帶北緣。保護(hù)區(qū)主要保護(hù)人參、紫椴、黃檗、野大豆等珍稀瀕危野生植物及其生境，保護(hù)天然側(cè)柏林、天然胡桃楸、天然蒙古櫟林等典型的原生植被和黑鸛、東方白鸛、金雕、大鴇等珍稀瀕危野生動(dòng)物及其棲息地。

　　青龍河保護(hù)區(qū)內(nèi)胡桃楸天然林面積較大，采集保護(hù)區(qū)內(nèi)胡桃楸優(yōu)良母樹(shù)種子，經(jīng)過(guò)晾曬、外皮清理后放在干燥、通風(fēng)、溫度20～25 ℃條件下備用。在接種前敲碎外殼，將種子尖部的合子胚(帶子葉少量)取出作為外植體用于不定芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)。

　　1.2 試驗(yàn)方法

　　1.2.1 外植體消毒預(yù)處理試驗(yàn)

　　外植體消毒試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)預(yù)處理，分別為：0.2%氯化汞溶液處理5 min、10 min;2%次氯酸鈉溶液處理10 min、15 min;紫外線直射10 min、15 min。預(yù)處理前先取合子胚置于75%酒精溶液中，30 min后撈出按照不同的預(yù)處理方案實(shí)施消毒處理，用無(wú)菌水沖洗4～5遍，最后在培養(yǎng)基上接種。所選擇的培養(yǎng)基為改良版的DKW空白培養(yǎng)基，其中每L培養(yǎng)基中另外添加了瓊脂6 g、蔗糖30 g，pH控制在5.8左右。6個(gè)處理均設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)內(nèi)有外植體8個(gè)。接種后2周進(jìn)行污染率、褐化率調(diào)查統(tǒng)計(jì)。

　　1.2.2 外植體培養(yǎng)方法預(yù)處理試驗(yàn)

　　試驗(yàn)中外植體經(jīng)過(guò)消毒后(選擇1.2.1試驗(yàn)中效果最好的消毒預(yù)處理方式)，轉(zhuǎn)移到暗環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間共設(shè)6個(gè)處理，分別為暗培養(yǎng)3、6、9、12、15、18 d。培養(yǎng)基選擇改良后的DKW培養(yǎng)基(每L培養(yǎng)基中另外添加了蔗糖30 g、瓊脂6 g、6-BA 2.0 mg、吲哚乙酸0.01 mg，pH控制在5.8左右)，對(duì)不同暗培養(yǎng)時(shí)間愈傷誘導(dǎo)率進(jìn)行調(diào)查。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)內(nèi)安排10個(gè)外植體。

　　按照不同時(shí)間處理后，將外植體接種到改良的DKW培養(yǎng)基上進(jìn)行光培養(yǎng)，在控制溫度25 ℃、光照強(qiáng)度1 500 lx、光照周期為14 h光照10 h黑暗的條件下培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)后不定芽誘導(dǎo)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

　　1.3 調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法

　　利用Excel、DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=外植體中產(chǎn)生愈傷組織的個(gè)數(shù)/外植體接種總個(gè)數(shù)×100;不定芽誘導(dǎo)率(%)=外植體中產(chǎn)生不定芽的個(gè)數(shù)/外植體接種總個(gè)數(shù)×100。各處理取3次重復(fù)平均值。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 不同消毒預(yù)處理方法對(duì)胡桃楸外植體消毒效果的影響

　　植物外植體消毒處理的效果直接影響后期組織培養(yǎng)的效果。本試驗(yàn)不同消毒預(yù)處理方法胡桃楸外植體污染率及褐化率見(jiàn)表1。根據(jù)表1可知，選擇胡桃楸的成熟胚作為外植體，消毒預(yù)處理的方法不同，污染率及褐化率表現(xiàn)也不同：0.2%氯化汞溶液處理5 min的污染率最高，達(dá)到70.23%，極顯著高于其他處理;其次是2%次氯酸鈉溶液處理10 min，污染率為47.28%，與0.2%氯化汞溶液處理10 min、2%次氯酸鈉溶液處理15 min的2個(gè)處理差異不顯著，但極顯著高于紫外線直射的2個(gè)處理;紫外線處理的污染率最低，且隨著直射時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率極顯著降低。根據(jù)表1可知，褐化率以0.2%氯化汞溶液處理10 min最高，達(dá)到62.12%，極顯著高于其他處理;其次是2%次氯酸鈉溶液的2個(gè)處理，但這2個(gè)處理之間差異不顯著;以紫外線直射的褐化率最低，為20%以下，且直射時(shí)間越長(zhǎng)，褐化率越低。