這篇轉(zhuǎn)基因論文發(fā)表了轉(zhuǎn)基因水稻中乳鐵蛋白的免疫作用，乳貼蛋白具有較好的免疫活性和抗氧化活性，是開發(fā)相關(guān)保健品的重要資源，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)為生產(chǎn)乳鐵蛋白提供了新的技術(shù)手段。可以將水稻中的乳貼蛋白提取出來，對于免疫力的提高和癌癥抵抗方面不可或缺。

　　關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因論文,轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白,抗氧化,免疫作用

　　人乳鐵蛋白(humanlactoferrin，hLF)是一種分子量約為80ku的多肽蛋白，主要存在于乳汁、眼淚、唾液等外分泌液或血漿、中性粒細(xì)胞中。hLF在人初乳中含量較高，達(dá)到6～8mg•mL-1[1]。hLF具有廣泛的生物學(xué)活性，如防止新生兒敗血癥，促進哺乳動物細(xì)胞生長，防輻射，抗菌，抗病毒，宿主防御和免疫調(diào)節(jié)功能，抗腫瘤等[2-6]，被認(rèn)為是一種新型的抗菌、抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品和飼料添加劑。乳鐵蛋白的多種生物學(xué)功能使其具有廣闊的應(yīng)用前景，以前乳鐵蛋白主要從動物乳中提取，但由于天然乳鐵蛋白在乳汁中含量低，高昂的成本限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。hLF更是由于缺乏原料，不能大量生產(chǎn)。在這種情況下，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)為生產(chǎn)乳鐵蛋白提供了新的技術(shù)手段。

　　1材料與方法

　　1.1材料rhLF

　　由浙江大學(xué)轉(zhuǎn)基因研究中心提供，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將hLF基因?qū)刖拘闼?10號獲得，乳鐵蛋白的含量占種子干質(zhì)量的05%，其提取過程按吳景歡等[19]報道的方法進行。RAW2647巨噬細(xì)胞株購于中科院上海生命科學(xué)研究院;DMEM(高糖)培養(yǎng)基購于Gibco公司、胎牛血清購于上海四季青公司;DPPH(1，1?二苯基?2?苦基肼)、ABTS[2，2?聯(lián)氮?二(3?乙基?苯并噻唑?6?磺酸)]、PBS，青霉素、鏈霉素、脂多糖、025%胰蛋白酶?EDTA和Griess試劑盒購于Sigma公司。其余試劑均為分析純試劑。

　　1.2蛋白檢測方法

　　分離純化后的rhLF濃度的測定采用SDS?PAGE法。用10%的分離膠和5%的積層膠，對收集到的蛋白樣品進行電泳，考馬斯亮藍(lán)染色法顯色蛋白條帶。

　　1.3rhLF清除自由基實驗

　　1.31清除DPPH自由基不同濃度的各樣品10mL，加入到3mLDP?PH(5mmol•L-1)中，搖勻，25℃放置30min，然后在515nm下測定其吸光度，以抗壞血酸為對照，DPPH清除活性可用以下公式來計算樣品的清除率：清除率(%)=[(D空白-D樣品)/D空白]×100。式中：D樣品為樣品溶液的吸光值;D空白為空白溶液的吸光值。

　　1.32清除ABTS+自由基ABTS+混合液的制備：將7mmol•L-1ABTS水溶液與245mmol•L-1過硫酸鉀水溶液混合，將混合液在室溫條件下避光放置12～16h，形成ABTS+自由基儲備液。將此工作液用磷酸緩沖液稀釋，在734nm下調(diào)其吸光度為0700±002，得到ABTS+混合液，于30℃下預(yù)熱備用。取05mL溶液加入1mLABTS+混合液混合均勻，室溫下避光靜置30min后于波長734nm下測定吸光值，以去離子水作為空白對照。ABTS+清除率(%)=(1-D樣品/07)×100。式中D樣品為樣品溶液的吸光值。

　　1.33清除羥基自由基活性1mL樣品液中加入6mmol•L-1FeSO4溶液1mL，混勻后加入6mmol•L-1H2O2溶液1mL，混勻后靜置10min，加入6mmol•L-1水楊酸1mL，混勻后37℃水浴反應(yīng)30min，3000r•min-1離心10min，取上清液于510nm處測定吸光值，以蒸餾水作為空白對照組，計算清除率。清除率(%)=[(D空白-D樣品)/D空白]×100。式中：D樣品為樣品溶液的吸光值;D空白為空白溶液的吸光值。

　　1.4rhLF對RAW2647細(xì)胞的作用研究

　　1.41小鼠巨噬細(xì)胞系RAW2647細(xì)胞培養(yǎng)采用DEME培養(yǎng)基(100U•mL-1青霉素和100μg•mL-1鏈霉素、10%FBS)，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長至90%時，用025%胰蛋白酶?EDTA消化細(xì)胞，傳代，取對數(shù)生長細(xì)胞進行實驗。

　　1.42RAW2647細(xì)胞增殖的檢測調(diào)整細(xì)胞密度為1×104mL-1，接種于96孔板，體積為100μL，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)24h，加入100μL不同濃度的rhLF，使最終濃度為00625，01250，02500，05000，10000和20000mg•mL-1，設(shè)空白對照組。以100μg•mL-15?FU為陽性對照，培養(yǎng)48h后加入CCK?8，輕輕振蕩，繼續(xù)培養(yǎng)2～4h。酶標(biāo)儀于490nm處檢測吸光值，每個平行濃度設(shè)3個重復(fù)。

　　1.43RAW2647細(xì)胞吞噬活性的檢測調(diào)整細(xì)胞密度為3×105mL-1，接種于96孔板，體積為100μL，于37℃，5%CO2下培養(yǎng)24h后，加入100μL不同濃度的測試樣品，使最終濃度為025～300mg•mL-1，設(shè)空白對照組。培養(yǎng)48h后棄去上清，每孔加入100μL0072%中性紅試劑，于37℃，5%CO2下培養(yǎng)箱孵育30min，棄去中性紅，用PBS清洗3次，每次100μL，并甩干。每孔加入醋酸?乙醇(體積比1∶1)細(xì)胞裂解液100μL，4℃過夜，用酶標(biāo)儀于570nm檢測吸光值，每個平行濃度設(shè)3個重復(fù)。

　　2結(jié)果與討論

　　2.1純化后的rhLFSDS?PAGE純度檢測

　　從轉(zhuǎn)基因水稻中經(jīng)硫酸銨分級沉淀、弱陽離子交換層析、分子篩層析及膜包脫鹽濃縮后，獲得較高純度的rhLF(圖1)。

　　2.2rhLF的抗氧化實驗

　　2.21rhLF的DPPH清除活性DPPH是一種非常穩(wěn)定的自由基，在517nm處有強吸收，當(dāng)遇到自由基清除劑時，其分子上的單電子被配對而使顏色變淺，可以用此來評價試樣的抗氧化能力[20]。從圖2可知，隨著濃度的增加，rhLF對DP?PH自由基的清除率逐漸升高，其濃度與清除度有良好的量效關(guān)系。在0125～4000mg•mL-1濃度下，rhLF的DPPH清除率在1832%～7890%。與陽性對照抗壞血酸相比，rhLF的清除率偏低。抗壞血酸在測試濃度范圍內(nèi)一直顯示了很強的抗氧化活性，即使在最低濃度下(0125mg•mL-1)，DPPH清除率也達(dá)到了8436%。2.22rhLF的清除ABTS自由基活性由圖3可知，rhLF對ABTS清除率隨著濃度的增加逐漸增大，總體上變化不劇烈，濃度與清除率存在很好的線性關(guān)系。在濃度為4mg•mL-1時，rhLF對ABTS的清除率達(dá)到了865%。陽性對照組抗壞血酸顯示了很強的抗氧化活性。在所測試的濃度范圍內(nèi)，抗壞血酸的ABTS清除率都非常高，最低也接近于90%。

　　2.23rhLF清除羥基自由活性在所有的氧自由基中，羥基自由最強，危害也最大，所以對清除羥基自由基的研究非常重要。H2O2爭奪金屬離子進而抑制羥基自由基的產(chǎn)生。如圖4所示，rhLF對羥基自由基的清除率隨濃度的增加逐漸增大，總體上變化不劇烈。抗壞血酸對羥基自由基的清除率隨濃度增大，先緩慢升高，當(dāng)達(dá)到某一閾值后急速升高，表現(xiàn)出很強的對羥基自由基的清除效果。相對于陽性對照抗壞血酸，rhLF的抗羥基自由基的活性很低，在測試濃度范圍內(nèi)，4mg•mL-1的濃度下，羥基自由基的清除率也僅為411%。而抗壞血酸在最低濃度(0125mg•mL-1)時，清除率就已達(dá)到了694%。本實驗通過研究rhLF對DPPH、ABTS及羥基自由基的清除效果來檢驗其抗氧化能力。結(jié)果顯示，rhLF對DPPH、ABTS和羥基自由基具有一定的清除能力，并呈現(xiàn)劑量依賴型。

　　2.3rhLF的免疫調(diào)節(jié)作用

　　2.31rhLF對RAW2647細(xì)胞增殖的影響由圖5可知，隨著rhLF濃度的增加，RAW2647細(xì)胞增殖率有所增高，當(dāng)濃度達(dá)到0.5圖4水稻轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白的清除羥基自由基活性Fig.4Scavengingeffectsofrecombinanthumanlacto?ferrinonhydroxylradicalmg•mL-1時，增加極顯著。當(dāng)濃度達(dá)到1mg•mL-1時，rhLF促進細(xì)胞增殖率最高(6241%)。隨著濃度的增加，對細(xì)胞的增殖有所下降。這說明，當(dāng)rhLF在低濃度時，顯著地促進RAW2647細(xì)胞的增殖，但是當(dāng)濃度增加到一定值時，會對細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制作用。綜上所述，rhLF在00625～10000mg•mL-1濃度范圍內(nèi)對RAW2647細(xì)胞具有良好的增殖作用，能提高巨噬細(xì)胞的密度和活力，對于提高機體免疫力具有很大的作用。

　　2.32rhLF對RAW2647吞噬活性的影響由圖6可知，當(dāng)濃度小于1mg•mL-1，RAW2647吞噬活性呈較快的升高，隨著濃度的升高，吞噬活性變化不大。整體上劑量關(guān)系依賴不強烈。在濃度為2mg•mL-1時，吞噬活性最高達(dá)到了6989%。綜上所述，rhLF在測試濃度范圍內(nèi)對RAW2647細(xì)胞吞噬活性有明顯的提高作用，它能增強RAW2647細(xì)胞對抗原的吞噬，進而加快巨噬細(xì)胞將抗原遞呈給其他免疫細(xì)胞，加速引發(fā)免疫反應(yīng)。本實驗研究了rhLF對RAW2647細(xì)胞增殖及吞噬能力的影響，發(fā)現(xiàn)其能夠促進細(xì)胞增殖分裂，刺激免疫細(xì)胞增殖分裂，在對應(yīng)外來抗原和自身癌變中具有重要的意義。rhLF提高了RAW2647的吞噬活性，進而提高了其捕捉抗原的能力，這對于提高機體免疫應(yīng)答有重要意義。rhLF對免疫細(xì)胞因子分泌的促進，對于免疫力的提高和癌癥抵抗方面不可或缺[21]。

　　作者：秦毅 呂國英 張作法 單位：浙江大學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)移中心 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所

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